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游离脂肪酸通过JNK途径促进胰腺中的β细胞自噬 最近有人发现高脂饮食的人，胰岛素抵抗受到诱导，并伴随着胰腺的β细胞自噬的增加。有实验数据表明（使用β细胞自噬特异性损失的小鼠为模型）当β细胞处于胰岛素抵抗状态时，β细胞将会诱导自噬以此来保护β细胞。而另一个介导自噬的诱导物则是血清中的游离脂肪酸（FFA），在胰岛素抵抗的情况下血清中的FFA有所增加。FFAs可以促进轻链由LC3-Ⅰ转变为LC3-Ⅱ，这种转变标志着β细胞的自噬被激活。 材料和方法 1、动物 Male C57BL6 db/misty和db/db mice；Male ob/ob 和Akita mice。 所有小鼠都置于无病原体的设施中，对其分别进行12小时的光照/黑暗处理，并喂以标准的啮齿动物食物和任意量的水。通过胶原酶消化的方法分别处理小鼠的胰岛细胞，并进行免疫印迹分析。 2、细胞培养及免疫印迹分析 棕榈酸酯和油酸酯在0.1N NaOH中溶解，而后与1mM棕榈酸和1% BSA加入RPMI-1640培养基中混匀。INS-1细胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640补充培养基上培养。为了能够观察到LC3-Ⅱ的积累，我们在培养的最后两个小时往培养基中加入了溶酶体抑制剂Pepstatin?A（10μg/ml）和E64d（10μg/ml）。免疫活性可通过FujiLAS 3000 system进行定性及定量。 3、电子显微镜分析 INS-1细胞以密度为5*106接种到培养基上培养3天。细胞首先在含有0.5mM棕榈酸酯或0.5%BSA的培养基上培养6h，然后加入2%戊二醛-2%多聚甲醛以及0.1M 磷酸buffer（pH7.2），置于4℃下培养过夜。然后用含有7.5%蔗糖的0.1M磷酸盐buffer（pH7.2）洗涤细胞。用刮刀收集细胞，将细胞置于含有2%四氧化锇的0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.2）中，在4℃下培养2h，最后加入1%的琼脂糖使其凝固。将样品切成碎块，用1%醋酸双氧铀染色，用不同浓度梯度的乙醇脱水，而后嵌入Epon812中。用Leica Ultracut UCT进行超薄切片，然后用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，用JEM-1230EX电子显微镜观察，电压为80kV。 4、长寿命蛋白 INS-1细胞以密度为2*105个细胞/孔（共24个孔）在培养基中培养3天。然后将细胞接种到含0.5 Ci/ml的14C-亮氨酸的培养基中培养24h。然后用PBS洗涤细胞，而后接种到含2mM未标记的亮氨酸的培养基中培养1.5h。然后再用PBS洗涤细胞，将细胞分别接种于含有及不含有蛋白酶抑制剂(EPN:10μg/ml E64d，10μg/ml胃酶抑素A和20mM NH4Cl )的培养基中，于37 ℃下培养3h。取出等量培养成分以及体积为培养成分的五分之一的50%三氯乙酸分别加入到等量的冰上。混合物在室内温度下培养5min，然后在15000rpm，4℃条件下离心5min。三氯乙酸放射性可用液体闪烁计数器（ liquid scintillation counter）测定。最后，用PBS洗涤培养物，然后在-20℃下培养几分钟。用冰的10%TCA洗涤培养物，而后使其在37℃下在500μl 1N NaOH中溶解20min。1N NaOH中的放射性由液体闪烁计数器测定，并由此可计算蛋白质降解量。 结果 1、FFAs在某些细胞系中诱导LC3-Ⅰ向LC3- Ⅱ转变 为了证明FFA诱导自噬，我们首先证实在INS-1细胞中，某些种类的FFAs会诱导LC3- Ⅰ转变为LC3- Ⅱ。油酸酯促进少量LC3- Ⅰ转变为LC3- Ⅱ，而棕榈酸酯则促进大量LC3- Ⅰ转变为LC3- Ⅱ。在加入油脂酸或棕榈酸酯6h内，LC3- Ⅰ向LC3- Ⅱ的转变加强。另外，自噬的诱导程度取决于FFAs的浓度。 2、棕榈酸酯加速INS-1细胞自噬通量 为了评估用棕榈酸酯处理过的INS-1细胞中的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变量的加强，自噬体形成的增加是否代表了细胞自噬通量的增加，我们使用了长寿命蛋白实验法（long-lived protein assay）。短寿命蛋白质，例如转录因子，与癌细胞有关的产物以及DNA聚合酶，都是通过泛素化-蛋白酶体途径降解的。因此，自噬通量可以通过长寿命蛋白的降解率被估算出来。用棕榈酸酯处理过的INS-1细胞与未用棕榈酸酯处理过的INS-1细胞相比，其长寿命蛋白的降解率显著地增加。 为了进一步证明蛋白质是通过自噬降解的，我们通过利用siRNA抑制自噬。siRNA的Atg7基因（自噬必须基因）的敲除导致90%的Atg7蛋白质的表达受到抑制。用siRNA处理过的INS-1细胞与未用siRNA处理的INS-1细胞相比，用siRNA处理过的INS-1细胞的蛋白质的降解率显著