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PCR技术的应用 一. 聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction） 聚合酶链式反应简称PCR。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 8.3.1聚合酶链反应的原理和操作 （一）工作原理 PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成的DNA合成。 （二）PCR的基本操作 PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①变性，通过加热使模板DNA 完全变成单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除； ② 退火，将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；③延伸，将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成新生DNA链延伸。 1. 模板DNA的变性，双链DNA 的变性温度由其G+C含量来决定，模板DNA的G+C含量越高，熔解温度也越高。一般来说，模板DNA经加热至94 ℃左右一定时后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 2. 模板DNA与引物的退火(复性)：退火是引物和模板DNA复性。复性过程采取的温度（Ta）至关重要。复性温度过高，引物不能和模板很好地复性，扩增效率很低。通常，模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 3.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TapDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可 PCR包括7种基本成分：模板DNA 、特异性引物 、热稳定、 DNA聚合酶 、dNTP 、二价阳离子 、缓冲液及一价阳离子。 获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR扩增仪所需的循环数 取决于反应系统中的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。 所以反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X) × n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 8.3.2 PCR反应条件 （一）PCR的基本成分  （二）PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数 1. ①温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃