分子遗传学8部分基因操作技术及其应用学习课件.pptVIP

重组DNA技术操作过程总结： 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 三、PCR技术：聚合酶链式反应（polymerase chain eaction,PCR ） Kary B. Mullis 1993，Kary B. Mullis PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。体外程序化的DNA合成技术。 1) 原理：模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段。 2) 反应体系：DNA模板，引物，dNTP，Taq DNA聚合酶，buffer 3) 反应程序： 变性 ( 94~95oC) 退火 延伸 ( 37~55 oC) ( 70~72 oC ) 72 oC延伸10min 30-35cycles DNA扩增100万倍 PCR特点及应用 优点：（1）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速； （2）微量的模板DNA即可扩增大量产物。 应用：（1）基因组DNA分析； （2）遗传物质的鉴定； （3）遗传病的诊断。 缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。 四、基因文库与分子杂交技术 （一）、基因文库 基因组文库 cDNA文库 （一）、基因文库 Southern blot （二）、分子杂交技术 Northern blot Western blot 基因组DNA文库（genomic DNA library） 将某一基因组DNA用适当的限制酶切断后，与载（质粒或噬菌体）体DNA重组，再全部转化宿主细胞，存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为G文库 （一）、基因文库 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组文库构建流程图 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 cDNA文库(cDNA library) 以某种细胞的全部mRNA为模板，利用逆转录酶合成与mRNA互补的DNA（cDNA）再复制成双链cDNA,与适当的载体连接后转化入受体菌，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。 C-文库具有组织细胞特异性。 组织或细胞RNA提取 反转录cDNA(double strand) 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 受体菌 cDNA文库构建流程图 cDNA library construction （二）、分子杂交技术 分子杂交（molecular hybridization）：标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。 分子杂交包括： DNA-DNA杂交（Southern blot）; DNA-RNA杂交（Northern blot）; 蛋白-蛋白杂交（Western blot）。 1、基因探针（gene probe） 基因探针（probe）：是指与一段目的基因或DNA/RNA片段特异杂交的核苷酸序列。可以是整个基因，或是基因的一部分，是DNA，也可以是RNA。 1）、探针标记 同位素：32P , 35S , 3H-dNTP等； 非同位素：地高辛-dNTP ，生物素-dNTP。 2）探针制备方法 缺口平移法（Nick translation） 随机引物法（Random primer） 末端标记法（Random primer） Nick Translation OH p OH+ P P DNA dNTP ，DNA酶I，DNA聚合酶I 32P-dNTP Bio-dNTP 随机引物标记探针 5` 3` 5` 5` 3` DNA 32p-dNTP,Bio-Dntp 6bp