GC脂肪酸分析MIDI试剂的准备和抽提步骤.doc

TSBA培养基是针对嗜氧菌(TSBA Media for Aerobes: TSBA6数据库) Trypticase Soy Broth Agar(TSBA)培养基是嗜氧菌标准的培养基。利用以下的配方作为TSBA培养基。供货商被建议在附加数据(Appendix A)中。 混合在2升的锥形瓶 Trypticase soy broth 30 grams Granulated agar 15 grams Distilled Water 1 liter 加热并搅拌至完全混合和琼脂(Agar)完全溶解 在温度121度及15psi下高压灭菌15分钟 注意事项：不可过度加热培养基，使用高压灭菌器须有温度及时间的设定装置。 在水浴中冷却至60度 加20-25 ml在溶解的琼脂(Agar)分装至无菌100 x 15mm直径的培养皿中，琼脂须有2.5-3.2mm深。 允许琼脂在室温下凝固，但如果培养基想储存一段时间，必须在24小时内包装在无菌装置中。它们可以保存在冷藏中直到使用。 注意事项——关于商业化已备好的TSBA培养基：TSBA可以从BBL购买，但需要指定货号，见附加数据(Appendix A)。使用其它供应商提供的TSBA培养基可能会导致结果不一致，用户需要用ATCC菌株验证培养基是否效果相当。 试剂的准备 (Reagent Preparation) 四种试剂要求是皂化细胞，脂化，萃取和基本洗涤脂肪酸的萃取物。试剂应准备在干净，棕色及可标示一公升的瓶子。放置一个Teflon-coated搅动台在每个瓶子上去添加在混合时。只有Teflon和玻璃可以接触到试剂。瓶子可以重新使用不须要重新浸润。自动分注的增加备置速度但是必须准备和确定适当的操作在每批样品使用前。确认分注试剂使用分注试剂在有刻度的量筒以达到校正效果。以下的配方准备试剂约够300个样品或许可以在先前调整以够配合实验室的样品量，试剂准备用VPI Anaerobe Method 和数据库在Appendix B中。 注意事项: 试剂1和4是腐蚀性和试剂2是酸性的全程配戴安全眼镜及手套，hexane 及methyl-tert-butyl ether (MTBE)在试剂3是可燃性的。熄灭所有的火焰或热源在使用前操作在一个化学性的抽气风盖之下。 试剂1-皂化试剂 (Ragent 1: Saponification Reagent) Sodium hydroxide (certified ACS) 45 grams Methanol (HPLC grade) 150ml Deionized distilled water 150ml 混合水和methanol 加入NaoH小球到溶剂中同时搅拌至锭剂完全溶解 试剂2-甲基化试剂 (Reagent 2: Methylation Reagent) 6.00N Hydrochloric Acid 325ml Methanol (HPLC grade ) 275ml 加酸液至methanol中搅拌 注意事项: 盐酸(Hydrochloric Acid)必须有保证浓缩。只有盐酸运送在玻璃瓶中是被允许的，和你的供给商讨论包装的信息，请参考供给的建议在Appendix A如果6.00N HCI无法取得资询你的制造商标示浓度在那批号上确认最终6.00N的溶液滴定对比一个标准基础溶液。 试剂3-萃取溶剂 (Reagent 3: Extraction Solvent) Hexane (HPLC Grade ) 200ml Methyl tert-buty1 ether (HPLC Grade) 200ml 加入MTBE 在hexane 中并搅拌均匀 试剂4-碱洗涤 (Reagent 4: Base Wash) Sodium hydroxide (Certified ACS) 10.8g Deionized distilled water 900ml 加入NaOH在水中同时搅拌至完全溶解 额外的试剂 (Additional Reagents) Saturated NaCl: 溶解40g 的ACS NaCl 在100ml的去离子水中 试剂的保存及有效期限 (Reagent Storage and Shelf Life) 建议每30天泡制新的试剂。可在瓶中保存在室温下使用Teflon-lined盖子。储存移吸管在干净的容器中。所