HPLC培训教材1.pptVIP

液相色谱基础 色谱方法发展 色谱的基本理论 色谱固定相和流动相 色谱系统 定性定量分析方法 简易故障排除 色谱方法的发展过程组分为何要进行分离色谱方法分类 不同的流动相和固定相构成不同分离方式 HPLC 与 GC 的应用差异液相色谱的分类 反相色谱是目前使用最普遍的一种色谱方法 吸附法 固定相为固体 硅胶silica 和 alumina（氧化铝） 是最常用的固定相 通过一系列的吸附/脱附步骤形成分离 溶质与溶剂均吸附在固定相极性端 样品分子对固定相的吸附程度不同而形成分离 分配法 溶质在液固两相间的相对溶解度不同而达到分离 与固定相亲和力强的物质其保留时间也较长 两种基本操作模式 正相分离：极性固定相、非极性流动相 反相分离：非极性固定相、极性流动相 分配法 正相与反相分离非极性相互作用 极性相互作用液相色谱仪器概述液相色谱仪器组成 溶剂传输系统（泵系统） 液相色谱仪器结构组成示意图液相色谱的应用 HPLC的特点和优点 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。 分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。 柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 色谱基本理论 色谱的主要理论 热力学理论 以相的平衡观点研究色谱过程 塔板理论为代表 (Martin Synge) 动力学理论 以动力学观点研究各种动力学因素对色谱峰的影响 Van Deemter 方程为代表 分离的原理 样品组分在固定相和流动相之间的分配 流动相带动样品经过色谱柱 不同组分与固定相之间相互作用的强度不同 不同组分在固定相上移动速度不同，形成分离 分配系数 KD XmXsKD1 = [Xs] / [Xm] YmYsKD2 = [Ys] / [Ym]样品组分的分离 分配系数K 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。 在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。 在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。 在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。 样品组分分离情况 A. 样品与色谱柱固定相无任何作用 三种样品在 t0 时间流出， 无保留 无保留时间 B. 样品组分保留时间一致 与色谱柱作用力相同 C. 样品组分保留时间不一致 样品各组分与色谱柱作用力不同 D. 实际分离状况 高斯分布曲线色谱出峰形状 实际出峰形状为高斯分布曲线 (Gaussian curve) 样品的扩散效应分离度分离效果与 k’ 值的最优化 k’值的优化 改变溶剂成分、梯度条件 (洗脱强度) 高效能的色谱分析的要求 从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施： ①进样时间要短。 ②填料粒度要小。 ③改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。 ④适当的流速。以H对u作图，则有一最佳线速度uopt，在此线速度时，H最小。一般在液相色谱中，uopt很小（大约0.03~0.1mm/s），在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在1mm/s的条件下操作。 ⑤较小的检测器死体积。 * * 高效液相色谱仪基础 培训课程 张蓉仙 Chromatography色谱M.S. Tswett 色谱的创始人—俄国植物学家 定量 定性 联用技术 样品纯化 成份分析 分离 气相色谱 液相色谱 流动相 固定相 固定相 流动相 正相色谱 反相色谱 非极