第八章 酶分子的定向进化.pptVIP

第 八章 酶分子的定向进化 第一节　简介 一、理论来源 随着电子科学的迅猛发展及计算机的广泛应用，酶学研究跨入了新的阶段。 利用基因工程的原理，可以在实验室中模拟自然界中的漫长进化过程，并由此建立了酶分子的定向进化方法，用于构建新的非天然酶或改造天然酶分子。 二、基本原理 对酶分子的研究可分为认识和改造两个方面。对酶分子的改造着重在两个方面： 通过各种方法对天然酶或其突变体进行研究，获得酶分子的各类信息，以此为依据对酶分子进行改造，这就是基于序列的合理化设计方案（sequential rational design），如化学修饰、定点突变等。 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基因重组、定向筛选等方法对酶进行改造，即利用基因的可操作性，模拟自然界的演化过程的非合理设计方案（irrational design），如定向进化、杂合进化等。 酶分子的定向进化（directed evolution）即属于蛋白质的非合理设计。 三、发展方向 酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业化要求，天然酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其他性质。因此，对天然酶分子水平上的改造，显得十分重要。 酶分子仍具有巨大的进化潜力，是酶的体外定向进化的基本先决条件。 酶分子存在进化潜力的主要原因如下： 天然酶在生物体内存在的环境与酶的实际应用环境不同 实际应用中，期待酶的活力和稳定性越高越好，但在生物体内对环境适应的进化主要表现在整体的适应能力、调控能力的增强 某些酶或蛋白质待进化的性质不是在生物体内所涉及的，如对蛋白质药物改造消除其副作用 四、定向进化的选择策略 虽然采用进化方法可提供新的有价值酶，即已经存在有足够大的突变库，但酶的功能突变常常被埋没在众多的中生突变和不利突变群中。 采用回交（backcrossing）法，将已进化的子代突变酶基因与野生酶基因组重组，可以排除这种干扰。 筛选或选择在酶的体外定向进化中至关重要，直接关系到定向进化的成败。因此，筛选方法必须灵敏，至少与目的性质相关 第二节　酶分子定向进化的历史 一、萌芽阶段 二、奠基阶段 三、发展阶段 一、萌芽阶段 　　第一次在分子水平上定向改造单一分子的是 20世纪六○年代Sol Spiegelman利用RNA噬菌体Q进行的体外扩增证明达尔文的自然选择也可以发生在非细胞体。 　　Q复制酶在基因组的指数扩增过程中以一定的频率向基因组中引入突变，导致不同基因组个体分子之间存在差异，形成一个突变库。此时基因组个体的选择压力就是复制速度，Q基因组不断剔除与Q复制酶识别序列无关的顺序以加快复制速度。 　　这个分子进化的实验巧妙地在体外模拟了自然进化的过程，但没有重要的应用价值。 　　大约20年后出现了真正有意义的改造酶分子性质的定向进化。 二、奠基阶段 1981年，Hall B G定向改变了大肠杆菌k12的第二半乳糖苷酶的底物专一性，获得了可以水解半乳糖、乳果糖、乳糖酸的突变酶。 1986年，Hageman R通过在高温下对含有卡那霉素的培养基中对携带卡那霉素核苷酸转移酶基因的突变库进行筛选得到了一个在63℃下稳定的突变酶和一个在70℃稳定的突变酶。 张今等为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题以天冬氨酸为模型通过控制DNA合成的碱基底物种类和浓度比例实现碱基对的错配，向目的基因引入突变同时限制突变减少筛选突变体的工作量，探索了一种称为酶法体外随机、定向改造酶分子的途径。 三、发展阶段 易错PCR(error-prone PCR)和DNA改组方法成功开发标志着酶分子定向进化技术的成熟。 在酶分子的定向进化改造中，易错PCR和DNA改组技术配合使用通过随机突变和优势重组来构建酶分子的基因突变库。 第三节　定向进化的策略 一、易错PCR技术为代表的无性进化 二、DNA改组技术为代表的有性进化 三、基因家族之间的同源重组 四、外显子改组 五、杂合酶 六、计算机辅助设计 七、突变库的构建及应用 一、易错PCR技术为代表的无性进化 易错PCR是在采用Taq酶进行PCR扩增 目的基因时，通过调整反应条件，改变Taq酶的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变构建突变库。 如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种dNTP浓度等。 关键：突变频率适中，理论上每个靶基因导入的取代残基个数为1.5～5之间。 连续易错PCR（sequential error-prone PCR），将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次获得的小突变累积产生重要的有益突变。 二、DNA改组技术为代表的有性进化 DNA改组又称有性PCR（sexual PCR），基本操作过程是从正突变基因库中分离出来的DNA片断用脱氧核糖核酸酶Ⅰ随机切割，得到的随机片断经过不加引物的