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实验八 琼脂糖凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶 一、目的要求 学习和掌握琼脂糖凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶的原理和方法 二、实验原理 琼脂糖凝胶分离各组分后，用活性染色鉴定 1、关于乳酸脱氢酶 1959年Markert等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱氢酶(LDH)分离出5条区带，由阳极到阴极依次命名为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，它们均具有LDH催化活性，从而首先提出了同工酶的概念。目前已知LDH同工酶是由H和M亚基按不同比例组成的四聚体。 LDH同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物各组织中LDH同工酶各组分含量不同。临床上对LDH及同工酶的检测可作为某些疾病诊断的依据之一。 1、关于乳酸脱氢酶 LDH升高而且LDH1LDH2，可见于心肌损伤、急性心肌梗塞、心肌病、溶血性贫血、恶性贫血、肺栓塞等。 LDH5升高而且LDH5LDH4，可见于肝硬化、肝癌、急性肝炎、肌炎、骨骼肌损伤。 LDH5LDH4都升高以LDH4更明显，可见于阻塞性黄疸。 2、乳酸脱氢酶同工酶活性染色 三、实验试剂及器材 血清 移液器 电泳仪 水平电泳槽 恒温培养箱 四、实验步骤 （一）、琼脂糖凝胶制作： 电泳槽放置平稳，将0.7％琼脂糖凝胶融化，倒入制胶槽中，冷却凝固后使用 ，注意不要有气泡 五、结果分析 六、注意事项 电泳时，电流不要太高，应防止热效应引起LDH同工酶失活。 LDH同工酶活性染色时间不要太长，一般以30－60min为宜，当大多数条带均显蓝紫色即可终止染色。 显色过程一定要避光 七、思考题 1、电泳显色后，5条深浅不等的蓝紫色区带，从最靠近阳极端区带开始，依次是哪些LDH？ 2、LDH的检测有什么生理学意义？ * * 用活性染色对LDH进行鉴定，将凝胶浸泡在活性染色液中，LDH与底物的反应，用甲硫吩嗪(PMS)作为电子的中间载体，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)作为最终电子受体，底物脱下的氢最后传递给NBT，NBT被还原后，产生蓝紫色的不溶于水的物质以对LDH定位。反应式如下： 电泳结果实例 LDH4 LDH3 LDH5 LDH1 LDH2 1 2 3 4 ＋ － LDH1 LDH2 LDH5 LDH4 LDH3 （二）、点样： 将凝胶放入电泳槽中，要缓冲液盖过凝胶，用枪加入10ul血清至加样孔中。点样端在阴极 （三）、电泳 电压150V，电流150mA电泳50min （四）、活性染色，脱色，照相： 电泳结束后，将凝胶转入装有活性染色液的培养皿中。轻轻摇动培养皿，使凝胶完全浸泡在染色液中，放入37℃恒温水浴中保温，染色过程注意避光，待大多数条带显现蓝紫色时除去染色液，显色时间一般为30 min。 加入脱色液终止酶促反应，摇动3~5 min，凝胶底色脱去直至背景清亮，数码相机照相。 记录电泳后谱带的结果. 最靠近阳极端的是LDH1，依次为LDH2、LDH3、LDH4和LDH5。由于正常人血清乳酸脱氢酶各同工酶的百分比是：LDH1 33.4%，LDH2 42.8%，LDH3 18.5%，LDH4 3.9%，LDH51.4%，故靠近正极的三条区带最明显，而LDH4和LDH5几乎不易观察到。