分子生物学第4章 病毒分子生物学_幻灯.pptVIP

1.重组型病毒载体 2.选择性删除部分必须基因，如删除早期调控基因，并导入细胞外源基因弥补该基因功能。 3. 无病毒基因的病毒载体（由重组载体和辅助系统组成） 重组载体：外源基因表达盒、病毒复制和包装所需顺式作用元件 辅助系统：病毒复制和包装所需反式作用元件 优点：安全、容量大 缺点：辅助病毒可能污染产品 2. 病毒载体的产生 3. 病毒载体在基因治疗中的应用 反转录病毒(Retrovirus, RV)载体 优点：基因转移的效率高，细胞宿主范围较广泛，DNA整合效率高于其它病毒载体等。 缺点：只感染分裂状态的细胞，载体容量小（≤8kb），目的基因在未分化的细胞中常丢失，随机整合潜在致癌的危险。 重组反转录病毒载体在转染反转录病毒包装细胞后可获得重组病毒颗粒 优点： 安全，不整合到染色体上 不需要宿主细胞的分裂增殖就能进入细胞 缺点： 免疫原性较强 不能整合到宿主细胞基因组使得外源基因表达持续时间有限 插入外源DNA的能力也有限（≤7kb）。? 腺病毒(AV)载体 缺乏AV时AAV潜伏的感染，当用AAV和AV共感染时，导致裂解感染，产生AAV粒子。 优点： AAV潜伏感染可转导DNA到各种细胞型（无论分裂的和未分裂的细胞） 基因组高度特异性地整合到人基因组中（人19号染色体上单一的整合位点） 缺点：插入外源DNA的能力有限（≤ 4.7 kb） 腺病毒相关病毒 （ AAV）载体 腺病毒相关病毒载体系统 优点： 嗜神经组织 能插入较长外源基因（20kb或略长些 缺点： 较大的基因组使得遗传操作较难进行 不整合到宿主细胞基因组，表达持续的时间受限 包含大量功能基因，安全水平尚待进一步观察 疱疹病毒（HSV）载体 ?优点： 安全，痘病毒在人类历史上已经广泛应用 外源基因的容量可达30 kb 适用广泛的细胞型（可感染非分裂的细胞） 缺点： 不整合入细胞基因组，故外源基因表达的时间不能持久 载体过大，受免疫系统的影响也较大。 痘病毒（Poxvirus, PV）载体 4. 基因治疗中问题 基因治疗：治疗基因 导入机体纠正或补偿相应基因功能 1.靶向性基因导入系统 基因治疗的关键问题是将治疗基因送入特定得靶细胞，并在该细胞中得到高效表达； 2.外源基因表达的可控性 导入基因后无调控表达将会产生严重后果。最理想的可控性是模拟人体内基因本身的调控形式； 3.治疗基因过少 导入基因的表达诱导框架图 四、非病毒载体 1. 裸DNA 2. 脂质体/DNA复合物 3. 多聚物/DNA复合物 4. 其它方法 1. 裸DNA 方法：直接注射或基因枪轰击 溶液类型对基因表达有影响： 重组DNA可贮存于5%~30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS 2. 脂质体/DNA复合物 1.形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 2.形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被细胞内吞。 1.无毒性和免疫原性 2.可生物降解，不会在体内堆积 3.可制成球状(0.03~50 ?m)，包容大小不同的生物分子 4.可带有不同的电荷 5.具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适应不同的生理要求 人工脂质体膜具有如下特点 3. 多聚物/DNA复合物 阳离子多聚体 DNA带负电 细胞表面带负电 4.其它方法 受体介导基因转移技术 磷酸钙共沉淀法 电穿孔法 显微注射法 * Ras genes in human tumors have been shown to be activated by single point mutations predominantly involving codons 12, 13, 59 and 61. Approximately 50% of colorectal cancers and 95% of pancreatic cancers contain mutations of a RAS gene. A significant subset of acute nonlymphocytic leukemias, thyroid cancers and adenocarcinomas of the lung also contain such mutations. In most other tumor types (e.g. cancers of the breast, prostate, stomach, bladder, liver and brain), however Ras mutations do not occur often if at all. As RAS genes are ubiquitously expressed and presumably