DNA序列测定..ppt

DNA序列测定 讲课内容： 一、Sanger双脱氧核苷酸链末端终止 法原理 二、化学裂解法原理 三、长链DNA序列测定的基本策略 四、DNA的序列分析的自动化 五、310 型DNA测序仪测定DNA序列的 基本步骤 DNA序列测定，是指DNA一级结构的测定，即DNA分子中核苷酸的排列顺序的测定。是现代分子生物学中一项重要技术。 DNA测序技术是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立和发展起来的。 该凝胶含6%~8%丙烯酰胺，具有分离DNA片段的分子筛效应,能分离仅有一个碱基差别,而长度达300~500个碱基的寡核苷酸片段。 含有高浓度尿素，具有破坏氢键及防止氢键形成的作用，以确保变性测序的DNA单链彼此不相联接，也不因分子内形成氢键而折叠 待测DNA片段 TGGAACCTC生成系列相差 TGGAACCT一个碱基的DNA TGGAACC片段 TGGAAC TGGAA TGGA TGG TG T -  TGGAACCT TGGAACC TGGAAC TGGAA TGGA  TGG  TG + T  目前应用的两种快速序列测定技术: Sanger等（1977年）提出的酶法-双脱氧链终止法 Maxam和Gilbert（1977年）提出的化学降解法 其中双脱氧链终止法是目前DNA序列分析应用最多最好的方法 基本原理： 通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3‘-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3’-OH末端（新掺入的脱氧核苷酸5’-P-OH与前一核苷酸的3’-OH以磷酸二脂键相连），使引物延伸，合成出新的互补DNA链。 如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），它与普通dNTP不同，它的戊糖的2’、3’-碳原子上均无-OH，由于它具有5’-P-OH能与前一核苷酸的3’-OH以磷酸二脂键相连，但因不具有3’-OH，故不能同后续的dNTP相连，于是DNA链的合成就此终止。 这样以待测序列的DNA为模板，加入引物和4种dNTP（其中一种为α-32P标记），将此反应物分为4等份，每份内加入一定比例的一种ddNTP，如此形成A、T、C、G四个反应体系，最后在各反应体系中加入DNA聚合酶催化DNA片段合成。这样各反应体系中即可形成一种全部具有相同的5’-引物端和一种以ddNTP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段。 DNA模板 ATTGCAGTCGAC生成的新链 TAACGTCAGCTG T管： C管：TAACGTCAGCT TAACGTCAGC  TAACGT TAACGTC T TAAC  G管： A管：TAACGTCAGCTG TAACGTCA TAACGTCAG TAA TAACG TA    将制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组一泳道，四条泳道相邻并列，每条泳道上按产物分子量小→大从正极到负极（胶板的下→上）分离开来，依次排列。 由于各产物均带有放射性标记，以上结果经放射自显影，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。