树叶中叶绿素的提取和分离.doc.docVIP

实验三 树叶中叶绿素的提取和分离 一、实验目的 1．掌握从树叶中提取叶绿素的方法； 2．了解薄层层析的原理，掌握薄层层析的一般操作和定性鉴定方法 二、实验内容 1、提取菜叶中叶绿素； 2、利用薄层层析法分离叶绿素中成分。 三、实验设备、仪器及材料 剪刀、干燥的定性滤纸、烧杯、研钵、玻璃漏斗、毛细管、天平、 试剂：丙酮、无水乙醇、层吸液（20份石油醚、2份丙酮、1份苯配置而成）、二氧化硅、碳酸钙、碳酸钠 材料：青菜叶 四、实验原理 1．叶绿素提取 高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a (C55H72O5N4Mg)、叶绿素b(C55H70O6N4Mg)、β—胡萝卜素(C40H56)和叶黄素(C40H56O2)等4种。叶绿素a和叶绿素b为吡咯衍生物与金属镁的配合物，胡萝卜素是一种橙色天然色素，属于四萜类，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中，β异构体含量最多。叶黄素为一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体中，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在乙醚中溶解度较小。根据它们的化学特性，可将它们从植物叶片中提取出来，并通过萃取、沉淀和色谱方法将它们分离开来。 2．薄层色谱 薄层层析是快速分离和定性分析微量物质的一种极为重要的实验技术，具有设备简单、操作方便而快速的特点。它是将固定相支持物均匀地铺在玻片上制成薄层板，将样品溶液点加在起点处，置于层析容器中用合适的溶剂展开而达到分离的目的。用此法分离时几乎不受温度的影响，可采用腐蚀性显色剂，而且可在高温下显色，特别适用于挥发性小或在较高温度下易发生反应的物质，同时也常用来跟踪有机反应或监测有机反应完成的程度。 薄层层析按分离机制不同可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等，最常用的为吸附薄层层析。吸附层析中样品在薄层板上经过连续、反复的被吸附刑吸附及展开剂解吸附过程，由于不同的物质被吸附剂吸附的能力及被展开剂解吸附的能力不同，放在薄层上以不同速度移动而得以分离。通常用比移值(Rf)表示物质移动的相对距离： Rf值计算示意图 1．起点线； 2. 展开剂前沿 a. 色斑最高浓度中心至原点中心的距离 b. 展开剂前沿至原点中心的距离 Rf值计算示意图 1．起点线； 2. 展开剂前沿 色斑最高浓度中心至原点中心的距离 b. 展开剂前沿至原点中心的距离 物质的比移值随化合物的结构、吸附剂、展开剂等不同而异，但在一定条件下每一种化合物的比移值都为一个特定的数值。故在相同条件下分别测定已知和未知化合物的比移值．再进行对照，即可对未知化合物鉴别。 五、实验步骤 1．提取绿色叶片中的色素 取几片绿色的叶片，去掉叶柄和主脉，用天平称取5g叶片，剪碎，放入研钵中。 向研钵中放入少许二氧化硅和碳酸钙，进行充分的研磨。用量筒量取5ml丙酮，倒入研钵中，迅速充分研磨。 2、将研磨液迅速倒入小玻璃漏斗中进行过滤。将滤液收集到一个小试管中，及时用棉塞将试管目塞紧。 3．制备滤纸条 取一块预先干燥处理过的定性滤纸，将滤纸剪成长10 cm、宽1cm的滤纸条，在距滤纸条一端1cm处用铅笔画一条细的横线，减去横线端滤纸的两个角。 4．画滤液细线、用毛细吸管吸取少量滤液，沿铅笔线均匀地画出一条细而直的滤液细线。待滤液于后，再画2~3次。 5．分离叶绿体中的色素 将3 mL层析液倒入烧杯中，将滤纸条有滤液细线的一端朝下）略微料靠着烧杯的内壁，轻轻地插入到层析液中，随后用培养皿盖盖上烧体；注意，不能让滤纸上的滤液细线触到层析液。 6.．观察实验结果 看到四种色素的颜色后，取出滤纸条，观察滤纸条上的色素带颜色、位置、宽窄。 六、实验结果 层析图片（标示出各种物质色斑）： 七、注意事项 1．滤纸在使用前要干燥。 2．植物叶片不要研成糊状，否则会给分离造成困难。 八、实验思考题 1、在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位置？ 2、展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色谱有何影响？ 附：菠菜中叶绿素的TLC(展开剂：石油醚：丙酮=2：1) 叶绿素：吡咯衍生物和镁的配合物，是植物进行光合作用必需的催化剂，易溶于石油醚等非极性溶剂中。