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实验二十五 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定蛋白质相对分子质量 一、目的要求 1、掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的原理。 2、巩固垂直板电泳的基本操作。 3、学会用该方法测定蛋白质的相对分子量。 二、原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。1967年，Shapiro等人发现，在聚丙烯酰胺凝胶中加入十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate，SDS)后，与SDS结合的蛋白质带有一致的负电荷，电泳时其迁移速率主要取决于它的Mr(相对分子质量)，而与所带电荷和形状无关。 当蛋白质的Mr在15000～200000之间时，蛋白质的Mr与电泳迁移率间的关系可用下式表示： lgMr=K-bm 图1 37种蛋白质的Mr对数与电泳相对迁移率关系图 Mr范围为11000～70000， 10％凝胶， pH=7.2, SDS-磷酸盐缓冲系统 式中，Mr为蛋白质的相对分子质量；m为迁移率；b为斜率；K为截距。均为常数。在条件一定时，b和K将已知相对分子质量的标准蛋白质的迁移率对Mr的对数作图，可得到一条标准曲线(如图1)。将未知相对分子质量的蛋白质样品，在相同的条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率可在标准曲线上查得它的相对分子质量。 SDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的非共价键 (氢键、疏水键)打开，并结合到蛋白质分子上(在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4 g SDS／g蛋白质)，形成蛋白质—SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。 SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质—SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的大小成正比地变化。这样的蛋白质—SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数。 SDS缓冲系统有连续系统和不连续系统。不连续SDS缓冲系统有较好的浓缩效应，近年趋向用不连续SDS缓冲系统。按所制成的凝胶形状又有垂直板型电泳和垂直柱型电泳。本实验采用SDS-不连续系统垂直板型凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量。 三、试剂与器材 （一）、试剂 1．标准蛋白质纯品：根据待测蛋白质的相对分子质量大小，选择4～6种已知相对分子质量的蛋白质纯品作为标准蛋白质。本实验采用的标准蛋白质见表1所示。 表1 5种标准蛋白质的相对分子质量 标准蛋白质 相对分子质量(道尔顿) 鸡蛋清溶菌酶 14400 胰蛋白酶抑制剂 21100 牛碳酸酐酶 31000 卵清蛋白 43000 牛血清清蛋白 67000 兔磷酸化酶B 97000 2．1％(V／V)TEMED溶液：取1 ml TEMED，加蒸馏水至100 ml，置于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存。 3．10％(W／V)过硫酸铵溶液：取过硫酸铵1 g，溶解于10ml蒸馏水中。最好现配现用。 4．0.05 mol·L－1，pH＝8.0 Tris-HCI缓冲溶液：称取Tris 0.61g，加入50ml蒸馏水使之溶解，再加入3ml l mol·L－1 HCl溶液，混匀后在pH计上调pH至8.0，最后加蒸馏水定容至100ml。 5． 蛋白质样品溶解液：SDS 100mg，巯基乙醇0.1 ml，甘油1.0ml，溴酚蓝2 mg，Tris-HCl缓冲溶液2ml，加蒸馏水至总体积10ml。 6．分离胶缓冲溶液：Tris 36.3 g，加入1 mol·L－1 HCl溶液48.0 ml，再加蒸馏水到100ml，pH=8.9。 7．浓缩胶缓冲溶液：Tris 5.98g，加1 mol·L－1 HCI溶液48.0ml，加蒸馏水到100ml，pH=6.7 8．凝胶贮液：Acr 30.0g，Bis 0.8g，加蒸馏水到100ml 9． 电极缓冲溶液：SDS l g，Tris 6g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水至1000ml，pH=8.3。 10．固定液：取50％甲醇454ml，冰醋酸46ml，混匀。 11．染色液：1.25 g考马斯亮蓝R-250，加454 ml 50％甲醇溶液和46ml冰醋酸，混匀。 12．脱色液：取冰醋酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水875 ml。 （二）