实验二 绿豆芽的蛋白质含量测定.docVIP

龙志敏 200930220121 09制药一班 实验二 绿豆芽的蛋白质含量测定 (考马斯亮蓝G-250比色法) 一、实验目的 1、了解考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理，掌握其测定方法。 2、熟练掌握分光光度计的使用技术。 二、实验原理 考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，该结合物在595nm波长下有最大光吸收。在一定的蛋白质浓度范围内(0～1000μg/mL)，其吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于可溶性蛋白质的定量测定。 三、仪器、试剂和材料 1、仪器设备 分析天平、10mL塑料离心管、5mL移液管、研钵、量筒、50mL离心管、10mL容量瓶、离心机、722型分光光度计 2、试剂 （1）标准蛋白质原液：称取100mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，即为1mg/mL的标准蛋白质原液。 （2）考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95%乙醇中，加入 85%（m/v）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。 3、材料： 绿豆芽 四、操作步骤 （一）绿豆芽蛋白质样品的制备 1、准确称取新鲜绿豆芽下胚轴2g，放入研钵中，加入2mL蒸馏水研成匀浆，转移至50mL 离心管中，再用6mL蒸馏水充分洗涤研钵，洗涤液收集于同一量筒中，定容至10ml,混匀； 2、冰浴中放置10-20 min以充分提取； 3、从量筒中取1ml至离心管，12000rpm离心5min，将上清液倒入10mL量筒，以蒸馏水定容至10mL，即得绿豆芽蛋白质样品溶液。 （二）标准曲线制作 2、高浓度标准曲线的制作（0～1000μg/mL） 取6 支1.5mL 的离心管，按表1.2 加入试剂，配制不同浓度的蛋白质标准液 试管号 0 1 2 3 4 5 1mg/mL 的标准蛋白质原液(mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质含量(μg) 0 200 400 600 800 1000 OD595nm 0 0.196 0. 346 0.487 0.602 0.781 另取6 支10 mL 的离心管，编号标记，从上述各管中分别吸取0.1mL 溶液，加入5 mL 考马斯亮蓝G-250 试剂，盖上离心管盖子，充分混匀，放置3min 后在595 nm 波长下比色测定（比色应在 l h 内完成），记录各管测定的光密度值OD595nm。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，制作蛋白质浓度为0～1000μg/mL的标准曲线如下： （三）绿豆芽蛋白质样品溶液浓度的测定 另取2 支10 mL 的离心管，分别加入0.l mL 绿豆芽蛋白质样品溶液，加入5 mL 考马斯亮蓝G-250 试剂，盖上离心管盖子，充分混匀，放置3min 后在595 nm 波长下比色，记录吸光度，如下表： 试管号 1 2 绿豆芽蛋白质样品溶液（ml） 0.1 0.1 OD595nm 0.224 0.235 计算吸光度平均值得：（0.224+0.235）/2=0.229 五、结果与分析 所测样品提取液的吸光度为0.229，代进标准曲线方程：Y=0.0008X得其相应的蛋白质含量为286.25μg 计算绿豆芽蛋白质含量=14.3μg 六、注意事项 1、蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合的反应迅速，反应在2 min左右达到平衡，其结合物在室温下1h内保持稳定。因此，比色应在出现蓝色3 min～l h内完成，不可放置太久。 2、考马斯亮蓝染色能力强，所用比色皿应及时清洗，否则会污染比色皿，影响吸光值测定。切不可使用石英比色皿测定。 3、高浓度的Tris 、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂对测定有干扰。 七、思考题 1、做好本实验的关键问题有哪些？ 答：研磨绿豆芽要充分；冰愈离心时间要足；比色应在出现蓝色3 min～l h内完成 2、如何正确使用分光光度计？ 答：1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。 　　 2.将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。） 　　3.根据所需波长转动波长选择钮。 　　4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。 　　5.在暗箱盖开启状态下调