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细胞与组织培养技术 动物细胞部分 实验安排： 第九周 实验一 动物细胞培养实验的器材准备 实验二 培养用液的配制及过滤除菌 第十周 实验三 培养细胞的形态观察 实验四 动物细胞的传代培养 实验五 培养细胞的超低温冻存 第十一周 实验六 冻存细胞的复苏 实验七 培养细胞的细胞计数与活性测定 第十二周 实验八 动物细胞的原代培养（大鼠骨髓间充质干细胞的培养） 细胞培养 是在体外模拟体内生理环境（温度、pH值、营养条件等）使从体内取出的细胞生存、生长繁殖的技术方法。 原代培养 又叫初代培养，是指从动物或人体内取出细胞，经过一定的处理和分离，置于适当的器皿或培养基等条件下，培养至第1次传代之前的细胞培养阶段。P17 传代培养 是指原代培养细胞在适应体外条件下后持续生长增殖，达到一定细胞密度后，需要将细胞从一个培养器皿以一定的比例转移到另一个装有新鲜培养基的器皿中的这样一个过程称为传代培养。 细胞培养的优点及不足之处 原代细胞培养的生命归宿 1.原代培养期：有细胞分裂，不旺盛；原代培养细胞与体内原组织在形态结构和动能活动上相似性大；细胞群呈异质性 2.传代期：持续时间最长，细胞增殖旺盛 3.衰退期：细胞增殖缓慢或不增殖；细胞轮廓增强，最后衰退死亡 培养细胞的生长方式 1.贴壁依赖型：必须贴附于支持物表面才能生长，大多数培养细胞都属于贴附生长型。 2.悬浮生长型：见于少数造血系统肿瘤细胞，胞体呈圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长，这类细胞容易大量繁殖。培养过程中需定期摇匀，使细胞与培养基充分接触。 每代贴壁细胞的生长过程 1.游离期 细胞接种后在培养基中呈悬浮状态，胞体呈圆形，持续时间约为10分钟-4小时 2.贴壁期 细胞附着于培养介质上，游离期结束，细胞株一般在10分钟-4小时贴壁，初代培养细胞贴壁慢，可长达24小时或者更多。 3.潜伏期 此期细胞有生长活动，少有细胞分裂，基本无增殖。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质有关。细胞株潜伏期一般为6-24小时。 4.对数生长期 细胞增殖最旺盛时刻，细胞数随时间变化成倍增长，细胞活力最佳，是进行各种实验的最佳时期。 5.停滞期 细胞数量达饱和状态，细胞虽有活力但不再分裂，细胞数量不再增加，应尽早传代。发生机制：接触抑制，密度依赖。 培养细胞的生长条件 1.营养需要：基础培养基、血清、促生长及促粘附因子 2.生存条件：温度 37±0.5℃ 气体条件 5%CO2 pH值条件 7.2-7.4 渗透压：等渗 3.无污染 4.无毒 实验一 动物细胞培养实验的器材准备 实验目的： 1.了解动物细胞培养的洁净要求，建立无菌操作的概念。 2.掌握细胞培养实验的材料准备过程。 3.掌握动物细胞培养用液的配制和酸碱度调节方法。 实验原理： 准备内容：1.实验用品的洗涤、包装和灭菌 2.准备酒精棉球，整理超净台 3.配制PBS KH2PO4 0.24g Nacl 8.0g KCl 0.2g NaHPO4 1.44g 加适量纯水溶解，调节pH值至7.4，定容至1000ml 实验二 动物培养用液的配制及过滤除菌 培养用液包括：培养基（需要添加血清） 消化液 平衡盐溶液 一、培养基 现在多采用合成培养基，其成分包括氨基酸、葡萄糖、维生素、无机盐及一些促生长因子、促贴壁因子等。常用的有RPMI1640、DMEM等。 二、血清 多使用胎牛血清或优质小牛血清 三、消化液 常用的消化液有胰蛋白酶、EDTA以及胶原酶溶液，以胰蛋白酶使用最多。酶液用于解离细胞间的蛋白质、胶原等，使细胞离散。EDTA是二价螯合剂，能结合钙离子、镁离子，使以来钙离子的的钙粘着蛋白失活而使细胞解离。 四、平衡盐溶液 如PBS、Hank’s液等 酚红对pH值的指示： pH值6.5 黄色 pH值7.0