Western基本步骤.docVIP

Westen blot 配胶 安装胶架 配胶 分离胶：10%（10ML） DdH2O 4 ml 30%Acr 3.3ml Tris-Hcl(8.8) 2.5ml 10%SDS 0.1ml 10%过硫酸铵 TEMED O.OO4ML 积层胶: 4ml DdH2O 2.7 ml 30%Acr 0.67ml Tris-Hcl(6.8) 0.5ml 10%SDS 0.04ml 10%过硫酸铵 TEMED O.OO4ML 注意事项：1、TEMED催化AP产生自由基，加速Acr凝胶聚合，一般于4度存放。不宜多加，否则胶易变硬脆裂。 TEMED易燃、腐蚀性、神经毒性，要注意防护。易挥发，使用后立即盖紧瓶盖，佩戴PE手套。 每加完一样晃匀，TEMED最后加。 灌胶 1、分离胶1ml枪吹打均匀，避免气泡，尽快灌入固定好的玻璃板中。 2、分离胶上灌满ddH2O，压平分离胶界面。待胶凝后可见分割折线。 可用乙醇代替ddH2O，分隔线先清楚后不清楚，待胶凝后又可见。 3、分离胶凝后，倒去顶部ddH2O，用滤纸吸干。 4、积层胶1ml枪吹打均匀，灌入玻璃板中至顶部。 5、插入梳子，注意梳子底部应无气泡。略倾斜插入梳子可避免出现气泡 6、20-30分钟后胶凝。 电泳 准备 1、装上电泳装置，倒入1*电泳液。先倒内槽（新）没过短玻璃板，如内槽不漏液再加外槽，没过钢丝电极即可，内外槽不能相通。 2、拔出梳子（用力均匀缓慢拔出），用10vl枪点样。 上样和电泳 1、10vl枪点样。（1.0胶最大上样量30vl，0.75胶最大上样量25vl） 2、样尽量点在中间孔位，空孔位用残样或5*buffer填补，避免边缘效应，使电流在胶板中均匀分布。 3、maker 3-3.5 vl。Maker一般-20℃保存，尽快上样尽快放入冰箱。 4、盖上电泳槽，接通电源。积层胶电压80V，分离胶160V。电流28mA。（恒压80V待Maker变红，转为160V，待成为一条直线） 注意事项：1、枪头顶着泳道正上方加样。 电泳时温度上升，用冰袋围绕电泳仪使降温。 跑分离胶电压在130-160V之间，低于130V时时间较长，高于150V时较快但温度高电压大易烧坏胶。 细胞蛋白上样10vl左右，组织蛋白上样20vl左右。 5、当需要上样量较大或超过孔位最大上样量时，可先加一部分样跑电泳，然后再加剩下样本，使全部分样本在积层胶内汇集。 三、转膜（湿法） 电泳结束后，撬开短玻璃板，切去积层胶，浸泡于转膜液。 用直尺或梳子量出凝胶大小，按尺寸剪滤纸和硝酸纤维素滤膜（PVDF膜）。 PVDF膜先浸入泡膜液（甲醇）中活化，然后放入转膜液中清洗。 海绵，滤纸，膜湿润，阴极电极（黑面）在下，从下到上顺序为：海绵，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵。膜与胶精准对齐，盖好滤纸后用玻璃棒赶出气泡。 转膜一般为80Ma,2小时。当目标蛋白为72bp以上时转3h，72bp以下时转1.5-2h。（210V，200MA，时间根据蛋白分子量来定） 注意事项：1、撬胶时尽量把胶留在厚板上，记录上样顺序。 2、滤纸为3层，可重复利用，但最好使用1-2次后更换。 染胶 考马斯亮蓝染料浸染，摇床5h。使用脱色液脱去多余染料，可见胶中有蛋白的部位出现蓝色条带，证明胶中相应条带有目的蛋白。 在转膜前染胶可验证所提蛋白中是否有目的蛋白；在转膜后染胶验证转膜知否彻底。 染膜 丽春红染料染膜，可见膜上有蛋白的部分出现红色条带，沿条带剪膜可避免漏剪或剪歪。用dd水即可洗净染料。 封闭 把膜放入装有封闭液的塑封袋中，一张膜1ml左右。30°摇床1h。 封闭液为3%BSA（牛血清蛋白），10mlddH2O加入0.3g。 注意事项：1、首次做蛋白时可不做封闭，此时膜显色后背景较深。看情况需要背景较浅时可做封闭。 2、封闭液4℃保存 结合一抗 1、蛋白一抗： 稀释液为含有1%BSA的TBST（稀释的比例按说明说来进行条件摸索） 2、将膜放入相应的塑封袋中，拍出气泡，4℃摇床过夜（12h）或常温2h摇床。 3、一张膜1.5ml左右，2张膜2-3ml，2张一起时膜的背面相贴。 注意事项：1、一抗放4℃保存半个月，可重复利用多次。应一抗价格昂贵一般使用3-4次。 2、稀释抗体使用含有1%BSA的TBST溶液。 结合二抗 1、取出一抗回收，膜使用1*TBST清洗，摇床，7min一次，洗三次。（LST 15min*2+5min*4 荧光二抗 10mlBS