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實驗九、冷凍細胞活化 日期：2005/11/24 預習： 凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶傷害細胞。細胞活化後，需立刻培養，儘速培養基，需數日或繼代一至二代，細胞生長及特性表現才會恢復。 步驟： 將冷凍管由－80℃冰箱中取出，放入37℃水浴中輕輕地搖動使得在微溫水中迅速地解凍 待冷凍管中還有一小塊冰塊，即取出37℃水浴，以 75%酒精擦拭冷凍管外部， 移入無菌操作台內的冰盒裡。 用擰乾的酒精棉花來擦拭冷凍管管口部分。取出 0.95ml 解凍之細胞懸浮液，加入有培養基之離心管中(10倍以上稀釋)，混合均勻，離心1,200 rpm, 5分鐘，移去上層液，加入新鮮培養基，混合均勻，放入培養皿中培養。 另取0.05ml解凍細胞懸浮液作細胞數測定，來計算活細胞的數目。 隔天換一次培養基，將死細胞去除 注意事項： 操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。自液態氮容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由於熱脹冷縮過程，此時蓋子易鬆掉。 隔天一定要換培養基，因為死細胞的毒素會毒害活細胞，所以必須將死細胞去除 對絕大多數細胞而言，1% 以下之冷凍保護劑-DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，但要對細胞沒傷害DMSO濃度要在0.2％以下。本實驗使用的DMSO濃度為0.75％，所以要當天去除DMSO。 用冷凍保存法再行解凍的細胞，細胞之最佳生存率的各種條件是隨著細胞的種類不同而會有些許的差異。 雖然是以慢慢地冷凍為佳，但不是冷凍的速度越慢，一定存活率越高。如果按照上述的步驟來操作，而可以得到50%的存活率便很滿足了。稍微快的冷凍速度( - 6℃/min左右時)，會有助提高有更高之存活率。 就保存容器來說，現在大多採用塑膠製成之冷凍管，從前採用玻璃製的冷凍管，玻璃會有破裂的危險泩，以及封管囗時相當麻煩；但是在超低溫保存過程中，塑膠管缺乏密敝性，往往會有液態氮進出冷凍管，造成污染。 冷凍保護劑DMSO之半透性優過於甘油(glycerol)。但是有些細胞會因DMSO引起分化，如果是這類細胞，需便用甘油。如果是採用甘油來做冷凍保護劑的話，則必須要加長冷凍前時間。 在- 80℃超低溫槽，或乾冰槽中也可以保存一年左右；所以在篩選細胞過程中，儲於- 80℃超低溫槽即可，選定特定細胞珠後，再凍入液態氮容器中。 結果： 圖一為活化後細胞用trypan blue染色後計數盤下的型態（未稀釋），可以看到有活細胞也有死細胞。表一為細胞計數的結果，平均存活率為73％。 討論： 在細胞冷凍前的平均存活率為88％，但是解凍後計數細胞的存活率下降為73％，可能是因為在冷凍或解凍過程加入的藥劑使細胞死亡，或是因為冰晶的傷害導致細胞死亡。解凍的個天換了一次medium，換medium時可以看到舊的medium中有許多懸浮死細胞，在顯微鏡下觀察可以發現貼附於培養皿底部的活細胞數很少，明顯的比計數時還要少，可能是因為死細胞所釋放的毒素使活細胞死亡，也因為這樣所以隔天必須換一次medium。24號解凍，25及28號皆有換medium，28號換medium時救medium中懸浮死細胞就較少，也有較多活細胞貼附於培養皿底部，29號在觀察細胞，細胞大約長到五分滿。到目前為止沒有觀察到有污染的現象 心得： 這次解凍細胞很緊張，因為很怕污染也很怕細胞通通死光光，但是到目前為止細胞都有在繼續生長，也沒有污染，真的很開心。冷凍及解凍細胞並沒有想像中那麼難，只要遵守一些原則就可以順利的冷凍及解凍細胞。 附錄： 表一.細胞解凍後利用trypan blue 與hemocytomerter 計數 HOS cell 之結果與計錄表 稀釋倍數 N1 N2 Nmean 推測細胞數目 (cells/ml) 平均值±標準差 (cells/ml) 存活率 ％ 存活率％ 平均值 16 total 42 46 44 7.0×106 6.9±0.3×106 73 73 dead 11 13 12 total 49 41 45 7.2×106 76 dead 12 10 11 total 39 44 41.5 6.6×106 71 dead 11 13 12 Nmean =N1+N2/2 細胞數目= Nmean×104×稀釋倍數 存活率=total Nmean－dead Nmean / Nmean ×％ 圖一. 活化後細胞用trypan blue染色後計數盤下的型態（未稀釋） 圖二. 活化後細胞用trypan blue染色後計數盤下的型態（未稀釋）