miR―30d通过抑制自噬影响喉癌细胞的增殖和耐药性.docVIP

miR―30d通过抑制自噬影响喉癌细胞的增殖和耐药性摘要：研究miR-30d抑制喉癌细胞株人喉癌表皮细胞（Hep-2）的发展和耐药性的作用机制。方法收取手术后的患者样本，液氮法保存新鲜喉癌组织和正常喉组织，实时定量荧光PCR法检测喉癌组织和正常组织中miR-30d的表达量。在Hep-2细胞系中采用脂质体转染的方法转染miR-30d寡聚核苷酸、miR-NC无义序列以及BECN1质粒，生物信息学方法预测miR-30d潜在靶点，双荧光素酶报告基因法验证miR-30d的靶点，Western blot技术检测蛋白表达量，CCK-8法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡。结果喉癌组织组织与正常组织相比miR-30d表达量明显降低，并随着世界卫生组织规定（WHO）的临床分期级数增加而更加明显。转染miR-30d寡聚核苷酸序列后，miR-30d表达量较对照组明显上调，并且转染miR-30d后能明显抑制人喉癌细胞的增殖、自噬水平和耐药性。生物信息学预测发现BECN1是miR-30d的潜在靶点，并且双荧光素酶报告基因和Western blot进一步验证了BECN1是其靶点。此外，过表达BECN1能够逆转miR-30d对Hep-2增殖、自噬水平和耐药性的抑制作用。结论在喉癌组织中miR30d量表达明显下调；miR-30d能够抑制喉癌细胞Hep-2的增殖、自噬水平和耐药性；BECN1是miR-30d的靶基因；过表达BECN1能逆转miR-30d对喉癌细胞的影响；miR-30d是潜在的人喉癌细胞早期诊断和基因治疗的候选靶点。关键词：MiR-30d；喉癌；自噬；BECN1喉癌（LSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，目前治疗喉癌的方式主要是手术和放疗，虽然近20年来喉癌的临床诊断和手术技术有了很大改进，但是由于喉癌临床用药的耐药性致使喉癌预后仍不甚理想[1-3]。MicroRNA（miR）是一种长度为18～25nt的单链非编码小分子RNA，miR的异常表达影响癌基因或者抑癌基因的表达从而影响肿瘤发生、发展和耐药等过程[4， 5]。自噬是细胞中普遍存在的生理机制，自噬在肿瘤发生、发展和肿瘤的耐药过程中起着重要的作用，目前许多研究表明miR能调节肿瘤自噬的水平来调节肿瘤的发生发展[6， 7]。BECN1 是形成自噬体的一个必需分子，它通过介导其它自噬蛋白定位于吞噬泡，来调控哺乳动物自噬体的形成与成熟，并且其通过调节自噬活性来影响肿瘤[8-10]。miR-30d在多种肿瘤里呈低表达并表现为抑癌作用[11]，本研究探讨miR-30d对喉癌细胞株人喉癌表皮细胞（Hep-2）细胞增殖、自噬水平和耐药性的影响，并发掘其作用靶点，探究miR-30d抑制喉癌的分子机制。1 资料与方法1.1 一般资料 人喉癌细胞系Hep-2来源于美国ATCC细胞库。DMEM培养基购自Hyclone公司。胎牛血清（FBS）购自Clark公司。OPTI-MEM无血清培养基、胰酶和EDTA购自Gbico。miR-NC mimics、miR-30d mimics购自锐博生物有限公司。BECN1质粒购自addgene公司。转染试剂Lipofectamine 2000、Annexin V FITC凋亡检测试剂盒和TRIzol购自Invitrogen公司。CCK-8检测试剂盒购自日本同仁化学研究所。5-氟尿嘧啶（ 5-fluorouracil，5-FU）购自sigma公司。M-MLV逆转录试剂盒、SYBR Premix Dimer EraserTM和Taq DNA 聚合酶购自TakaRa公司。TransStartFastPfu DNA Polymerase试剂盒购自北京全式金公司。胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Axygen公司。Dual-Luciferase Reporter Assay 试剂盒购自Promega公司。RIPA细胞裂解液和BCA蛋白检测试剂盒购自碧云天公司。PVDF膜购自whatman公司。ECL化学发光试剂购自Pierce公司。BECN1抗体和LC3抗体购自Sigma公司。GAPDH抗体购自Bioworld公司。1.2方法1.2.1细胞培养与转染 细胞按照推荐的培养方法，将细胞接种到六孔板。转染前细胞内加无血清细胞培养液，将所要转染的mimics或者质粒加入OPTI-MEM中轻轻混匀，同时将Lipofectamine 2000加入另一管OPTI-MEM中轻轻混匀，静置5min后，将上述两种溶液混合，室温孵育30min后吸去六孔板中的培养液，将上述混合液加入培养皿，随后轻轻混匀，细胞培养箱内培养3～6h后，吸除培养液，加入新鲜细胞培养液继续培养。1.2.2 细胞增殖检测 将转染的Hep-2细胞消化，将细胞传代至96孔板，每隔24h检测细胞活性。用PBS十倍稀释CCK-8溶液，吸尽培养板