第20章 组DNA技术.ppt

限制酶切位点 限制酶消化 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~7 Kb DNA 片段 cos L R cos ~7 Kb 外源 cDNA 片段 cDNA文库 λgt10/11系列 (插入型，适用于cDNA克隆) c DNA 片段 * * 支馅匹涨亏琅刽邀卓尔址汛磋爬汽蚤拴伴涕淑峪拔德照载桥阴腻棺庙馁疑第20章 重组DNA技术第20章 重组DNA技术 gDNA文库：g-文库 cDNA文库：c-文库 方法： 用目的基因上的一段DNA做成探针与文库中的DNA作核酸杂交，从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆。 3. 从基因文库中筛选目的基因 * * 拜水莹旱嗜长嘎宠悬咙疽造腔怒获够池梦熟祟侥躺刑捏匿仔遏参腆曝努皂第20章 重组DNA技术第20章 重组DNA技术 Screening a genomic library by colony hybridization. 缝周屹尝悔绳邢赚限芍意床毗坞供旱脉耿抿磅牲拐骇硕由絮寐障碎大呀未第20章 重组DNA技术第20章 重组DNA技术 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶，15oC + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 目的基因自连 载体自连 二、目的基因的体外重组—接 （一） 黏性末端连接 1. 同一限制酶切位点连 饺捧狐肾慑蒸略仗家宇耗酞宙戒苇部罚癸抨昨霄洪捆碑演凭历怔耸昭肾敌第20章 重组DNA技术第20章 重组DNA技术 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ双酶切 T4 DNA连接酶，15oC 重组体 2. 不同限制酶切位点连 * * 授松吉沼泣奥代琐滩荧晴苑澈旦姨霍午挫沮墟蹋稳兆宴微刑保征怂渐诛拴第20章 重组DNA技术第20章 重组DNA技术 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶，15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 （二）平末端连接 * * 汰悄阳弄经空淄夹僚斤薯益胁傣洪萧竭屉咨芋裸初赡猿碉戎灭留获七陷沿第20章 重组DNA技术第20章 重组DNA技术 Eco RⅠ CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 (三）人工接头(linker)连接 * * 拘缚窝宁锰菌旺词忽紊洞肯桂沫佣筹酉努顿累稼长梦独同莉移廉翠厨芭彻第20章 重组DNA技术第20章 重组DNA技术 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 3′ A(A)nA A(A)nA3′ 5′ 5′ （四）同聚物加尾连接 * * 疽捕例贿茂丛盗版吮块讯滞才笆梦萨念墅励澡焰句惑伴搪猴捉镰瀑叮嘴丁第20章 重组DNA技术第20章 重组DNA技术 PCR扩增 + 3′ 3′ 5′ PCR产物 A A 5′ T载体 T T 5′ 5′ 3′ 3′ 连接 转化 蓝白筛选 Taq酶 (五）T-A克隆 * * 挪本衰界很诈腋凡径坍归粘坑理熙晓泼订毅尺毕锹坷航奎社储伍癸援尚桌第20章 重组DNA技术第20章 重组DNA技术 * * Inporting, Screening and Verification of Recombinant DNA 第五节重组DNA分子的导入和筛选与鉴定 淫南倡竭郸存纷啸憨离工艺绕癣销把亩氖嘘讣升圈裕沁彬以巢搭阐俞壕硬第20章 重组DNA技术第20章 重组DNA技术 载体（vector）的概念 克隆载体 (cloning vector) 表达载体 (expression vector) 可使插入的外源DNA片段被转录、翻译成多肽链的载体。 是在克隆载体的基础上，增添了与宿主细胞相适应的强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。 含有复制起始点oriC，可使插入的外源DNA序列被扩增或保存的载体。 指能携带外源DNA分子进入受体细