实验三 石蜡切片法幻灯片.ppt

实验三 石蜡切片法  一般光镜技术 组织细胞化学技术 免疫细胞化学技术 放射自显影技术 电镜技术 组织培养技术 组织学的研究方法 涂片法 铺片法 磨片法 石蜡切片法 火棉胶切片法 冰冻切片法 一般光镜技术 非切片法 切片法 本实验主要掌握一般光镜技术中的切片法——石蜡切片技术。 实验目的与基本要求： 掌握石蜡切片的制片技术和基本原理。 要求用HE染色方法染色，获得清晰的组织切片。 石蜡切片的流程 1、取材 2、固定 3、组织块修整 4、洗涤 5、脱水 6、透明 7、浸蜡与包埋 8、切片与贴片 9、脱蜡、复水（水化） 10、染色 11、脱水、透明 12、封固 1.取材 动物致死方法：常用方法有麻醉法、空气栓塞法、断头法、击头法、股动脉放血法等；无尾两栖类常用探针破坏脑和脊髓的方法处死，鼠类可用两手（戴手套）用力拉，使颅骨和颈椎分离而导致延髓损伤致死。 动物保护 组织材料新鲜 动作迅速 取材注意事项： 要熟悉取材部位； 所取材料尽可能新鲜； 组织块力求小而薄：厚度一般不超过5mm为宜，较理想的厚度为2mm左右； 勿使组织块受挤压，以免破坏组织； 保持材料清洁，以免影响观察。 2.固定 固定：固定是指处死的动物体或新取的组织块投入固定液使其结构得以凝固为不溶性物质的过程。其目的在于保持组织内细胞的形态、结构及其组成，防止细胞组织死后的自溶和腐败，使之尽量保持生前的状态和结构。 注射、灌注固定法 小块组织固定法 常用的固定液有：甲醛（福尔马林）、酒精、醋酸、苦味酸、锇酸、Bouins液等。 固定液的用量通常为材料块的20倍左右；固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。 常用的固定方法 3.组织块修整 组织块修整：经过固定后的组织有一定的硬度，此时就可以做一些修整，但改变不要太大，只要将组织材料切取平整，修掉一些不规则的部位；过大、过厚的组织改小、改薄。 4.洗涤 洗涤：将残余在组织内的固定液清洗干净，以免影响对组织内部结构的观察、分析、研究。 常用的洗涤方法 水洗法（含有铬、锇的固定液固定的组织块） 酒精洗涤法（含有苦味酸、酒精固定液固定的组织块） 5.脱水 脱水：将组织块内的水份被置换出的过程叫脱水；脱水目的是使水分完全除去的同时使组织块变硬。 现采用的脱水剂一般是乙醇或丙酮来进行梯度脱水；脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。 方法： 70%→ 80%→ 95%(ⅰ)→ 95%(ⅱ) →无水酒精（ⅰ）→ 1-2h 1-2h 1-2h 1-2h 30min-1h 无水酒精（ⅱ） 30min-1h 脱水注意事项： 原则是在脱水彻底的前提下，尽量缩短脱水的时间； 脱水应逐步而不应跨越太大进行； 如需要可在70%的酒精中过夜或长期保存； 如系胚胎或柔软组织脱水，应从更低浓度的酒精开始； 每级脱水移入高浓度以前，应用吸水纸吸净表面的残液。 6.透明（媒浸） 透明（媒浸）：无水酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。 常用的透明剂有二甲苯、苯；透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小和性质而定。 方法: 纯酒精:二甲苯（1:1) →二甲苯(ⅰ) →二甲苯（ⅱ） 15min-30min 15min-30min 15min-30min 7.浸蜡与包埋 浸蜡：是将已透明的组织块移入熔化的石蜡内浸没的过程。目的是用石蜡取代透明剂，使石