微生物学实验3-11 -cmx2010幻灯片.ppt

实验3 实验室环境及人体表面微生物的检查分离 目的要求 1.证实实验室环境与人体表明存在微生物。 2.体会无菌操作的重要性。 3.观察不同类群微生物的菌落形态特征。 4.无菌操作，将分离的典型菌落划线培养于固体斜面。 原理 通过培养的方法使 肉眼看不见的单个菌体在固体培养基上，经过生长繁殖形成几百万个菌聚集在一起的肉眼可见的菌落。 操作步骤 思考题 体会 实验报告 根据p8表格填写实验报告。 实验4 显微镜的使用及细菌的简单染色法 6. 双眼同时睁开观察，减少眼睛疲劳，且可同时画图和记录。 7. 可不佩戴眼睛操作，注意不要压破载玻片，不触碰样品处 8. 双眼聚焦于同一个视野。。。。。。 油镜使用 待后面演示 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料．如伊红美蓝、伊红天青等。 三、实验材料 奥林巴斯普通光学显微镜（复式显微镜） 同学们分离纯化培养的不同菌株 草酸铵结晶紫染液，齐氏石炭酸复红染液 载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。 （1）涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，用另外一个载玻片向一侧推菌悬液滴一次，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2。 （2）干燥将涂片于室温中自然干燥。 （3）固定手执载片—端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏。 （4）染色将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min。 （5）水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止。 （6）干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体。 （7）待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。 注意事项 1．载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多（1小黄豆），挑菌量宜适中，菌膜宜薄，切忌过厚（不要来回涂抹）。 2．在染色过程中，不可使染液干涸。 3. 无菌操作，接种环一定要冷却后再取菌。 4.涂片干燥后加热固定，加热时间不宜过长（3-6次） 问题和思考 1．涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题? 2．制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？ 3.使用油镜时，为什么必须用香柏油？ 4.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？ 五、实验报告 (一)绘图（细菌形态图）P46 (二)单染色法操作要点。 实验4 革兰氏染色法荚膜染色 一、实验目的 目的： 1.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术; 2.学习革兰氏染色法以及荚膜染色法； 3.掌握染色原理。 二、原理 革兰氏染色法法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G－)和革兰氏阴性菌(G＋)两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G－菌和G＋菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄(10nm,2-3层)、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G＋菌细胞壁中肽聚糖层厚（20-80nm，15-50层）且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 革兰氏染色的实际意义 　(1)鉴别细菌:用此染色法可将所有细菌分为两大类,这样可将致病菌的范围缩小,然后再进一步鉴定. 　(2)选择药物:革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在细胞壁等结构上有很大差别,因而对抗菌素等药物的敏感度不一.例如大多数阳性菌对青霉素敏感，大多数阴性菌对青霉素不敏感(脑膜炎球菌等除外),可供临床实践中选用抗菌药物的参考. 　(3)与致病性的关系:大多数革兰氏阳性菌的致病物质主要为外毒素;而大多数革兰氏阴性菌的致病物质主要为 荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，含水量大，其他成分多为多糖、多肽或糖蛋白。 细菌荚膜染色的原理是因为荚膜和染料间的亲和力弱，不易着色，且易被水洗去，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体