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第17讲 核酸杂交技术 Northern杂交与斑点杂交 温故知新 我们一起回顾上节课所学的Southern杂交： 一、DNA的变性 二、DNA的复性 三、核酸分子杂交技术 四、Southern杂交的原理和主要步骤 一、Northern杂交的由来 二、Northern杂交的用途 三、Northern杂交的基本流程 四、Northern杂交的优点和缺点 五、Northern杂交、Southern杂交和Western杂交的区别 六、斑点印迹杂交的原理 七、斑点印迹杂交的基本流程 八、课堂小结 九、作业 一、Northern杂交的由来 Northern杂交由斯坦福大学的George Stark教授于1975年发明。其原理是在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 之所以命名为Northern杂交是因为其原理与Edwin Mellor Southern教授发明的southern杂交原理相似，实验过程也相似，所以取了一个类似的名字叫Northern杂交。 二、Northern杂交的用途 1、检测外源基因在宿主中能否转录。 2、检测mRNA长度分子量大小，提供有关RNA完整性信息和不同的剪接信息。（依电泳迁移率估计）； 3、mRNA的含量，即基因表达高低。（密度扫描仪，定量分析） 三、Northern杂交的基本流程 三、Northern杂交的基本流程 1、RNA的提取 ①样品细胞的有效破碎 ②使核蛋白复合体变性 ③对内源RNA酶的有效抑制 ④有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离 三、Northern杂交的基本流程 1、RNA的提取 一个标准的印迹程序，第一步是提取样本的总RNA，在通过挂有oligo(dT)的色谱柱通过亲和层析分离纯化总RNA中的ｍＲＮＡ。然后通过甲醛变性胶将ｍＲＮＡ进一步按大小分离开。并通过溴化乙啶（ＥＢ）染色在转印前来检查ＲＮＡ的质量。 也可以使用含有尿素的的聚丙烯酰胺胶在分离已经片段化的ＲＮＡ和小ＲＮＡ。在跑电泳时可加入ＲＮＡｍａｒｋｅｒ以方便对ＲＮＡ大小的观察。 当然，在总RNA样品中，核糖体亚基也可以充当marker的功能（28s的条带相当于5kb，而18s相当于2kb）。 三、Northern杂交的基本流程 三、Northern杂交的基本流程 2、转膜 Northern杂交所用的是尼龙膜带有正电荷，对带有负电性核酸具有高亲和性。在转膜时使用的转膜缓冲液里面含有甲酰胺，甲酰胺可以降低杂交时RNA的退火温度以防止由于高温而产生的RNA的降解。在热和紫外线的作用下，RNA于尼龙膜间形成了共价键，从而被固定住。当探针与之结合时，特定的RNA就在膜上被标记了下来。 三、Northern杂交的基本流程 3、杂交 杂交的效果受到离子强度、黏度、碱基的错配、探针的序列的因素影响。杂交结束后，在洗膜时，一定要保证将没有杂上的探针清洗干净，才能保证高信噪比。最后，使用X光片进行显影，并进行定量。 三、Northern杂交的基本流程 3、杂交 Northern杂交可以选用放射性同位素标记或地高辛（DIG）和生物素（BIOTIN）标记的RNA探针或DNA探针。 RNA探针具有显示更强的杂交信号和更低的非特异性背景的优点，因此只要可能， George Stark可尽量选用RNA探针。 但由于RNA的不稳定性，RNA探针在操作上的要求和难度要比使用DNA探针高很多，因此大多数研究者仍使用DNA探针。 四、Northern杂交的优点与缺点 如今在做基因的表达分析时，有多种技术可供选择，包括：RT-PCR、RNA酶保护试验、微阵列、基因表达的系列分析以及northern杂交。 虽然，微阵列基因芯片技术被广泛应用，但在对特定基因微小的表达量变化的测定上，northern杂交的灵敏度还优于微阵列技术。 四、Northern杂交的优点与缺点 1、微阵列技术优于northern基因的地方主要是它可以大通量的同时检测数千个基因，这是northern杂交所做不到的。 2、在试验中大量用到有毒有害的试剂包括：DEPC、甲醛、EB、紫外线、放射性同位素等。对于研究人员具有很大的危害。 3、Northern blot的操作步骤相当繁琐，且对RNase污染非常敏感，任一步操作不当都会严重影响实验结果。 五、Northern杂交、South