重组表达门冬酰胺酶II工程菌的构建讲义.doc

实验 重组门冬酰胺酶II的制备与分析 组员 ：1144301 吴雅云 1144302 王世静 1144303 奚建涛 1144304 逄淑云 实验目的 1. 了解构建重组质粒的原理 2. 掌握质粒提取方法、PCR技术、酶切等基本技术方法 3. 了解原核细胞表达重组蛋白载体的原理 4. 掌握重组质粒的初步鉴定方法 5. 了解重组工程菌发酵培养、诱导表达重组门冬酰胺酶II的原 6. 了解重组门冬酰胺酶II通过透析法脱盐 7. 掌握透析法的基本操作 8. 了解离子柱交换吸附技术的原理 9. 掌握离子柱交换吸附技术分离、纯化重组门冬酰胺酶II的方法。 实验原理 门冬酰胺酶，别名L-门冬酰胺酶、天冬酰胺酶或天门冬酰胺酶。L-天冬酰胺是细胞合成蛋白质的必需氨基酸。肿瘤细胞中的天冬酰胺合成酶含量非常低，故自身不能合成L-天冬酰胺，需依赖外源L-天冬酰胺才能生存。而L-天冬酰胺酶可通过降解L-天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞中蛋白质的正常合成，导致肿瘤细胞的死亡。人体内正常细胞则因能自身合成L-天冬酰胺，所以受L-ASP的影响较小。故L-ASP可用于急性淋巴细胞白血病的治疗。目前临床上使用的L-ASP泛指来源于大肠杆菌的E. L-ASP II。从1974年天津生化制药厂开始生产L-ASP，到1995年吴梧桐教授等进行的E.天冬酰胺酶基因的克隆和表达研究，并首次在国内成功构建了高效表达L-ASP的基因工程菌/ CPU210009，工程菌发酵单位比野生株高出100倍。随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺，确定了重组L-ASP 的纯化路线，并对重组产品进行了鉴定。L-ASP的制备纯化工艺越来越成熟，这些研究成果为我国工业化生产优质、低价的注射用E. L-ASP开辟了新的道路。 cDNA克隆包含了相应mRNA分子完整的5＇非编码区序列，为研究目的基因在翻译水平上调控机理奠定了重要基础。 聚合酶链式反应，简称PCR。聚合酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，利用DNA变性和复性的特点，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 化合物诱导转化法原理外源 DNA 与多聚物（聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等）、 二价阳离子（Mg 、Ca 、Mn等）混合，再与受体细胞或原生质体混合，可使外源 DNA进入细胞S.O.C比LB 培养基更有营养，因此导致细菌的快速生长;相对于LB 培养基S.O.C 培养基中转化株不仅可以在其后的1 h 就观察到而且转化效率较高S.O.C 培养基比LB 培养基的效率高出10 ～30 倍OD260和OD280,计算其纯度及比值。 2.cDNA合成和文库构建 根据RNA浓度确定RNA模板量。按Clontech的SmartTM cDNA Library Construction Kit 使用手册进行，cDNA合成使用长距离PCR方法。依次加入SMART IV Oligonucleotide、3＇PCR Primer及dNTP，在反转录酶作用下合成第一链。再以第一链cDNA为模板，依次加入dNTP Mix、5＇PCR Prime、3＇PCR Primer、Advantage 2 Polymerase Mix 在 PCR仪上进行扩增，共30个循环。PCR产物经蛋白酶K消化、SfiI酶切以及CHROMA SPIN-400 column大小分级。按照cDNA：Vector=1：2/1：1/3：2三种方式进行连接。每一个连接建立一个独立的λ噬菌体包装反应。 3.文库质量鉴定 事先制备好宿主菌的液体培养物，37℃，140r/min培养，直到培养液OD600至2.0。离心，弃上清，用MgSO4 重悬沉淀。取3种连接方式不同稀释度的包装产物各100μl，分别与200μl宿主菌过夜培养物混合，在37℃培养10～15min，各加入5ml融化的LB/MgSO4 上层琼脂，混合，立即倒入37℃预热的LB/MgSO4平板上，水平涂布，冷却10min，37℃培养6～18h，计数噬斑，计算滴度（pfu/ml）=噬菌斑数×稀释因子×1000/稀释的噬菌体铺板体积（μl）。取2ml融化的上层琼脂，依次加入50μl IPTG和X-Gal贮存液、5μl不同稀释度包装产物与宿主菌的混合物，计数蓝、白斑，计算重组效率=白斑数/（白斑数+蓝斑数）。 4.文库的PCR鉴定 随机挑选了12个噬菌斑进行噬菌粒的转化及碱裂解提取质粒作为模板，分别依次加入5＇PCR Primer—CTCGGAAGCGCGCATTGTGTT ，3＇PCR Primer—