基因表达调控2(免费阅读).pptVIP

* 基因表达与调控 研究基因转录调控的方法 Reporter gene assay EMSA (Electrophoretic mobility shift assay) Foot-pringting Methylation assay Tet/off and Tet/on assay Northern Blotting ChIP SAGE Western blotting assay Electrophoretic mobility shift assay （EMSA） -- Method for Identifying DNA-Protein Complex Super-shift assay DNA 甲基化分析 To identifying methylation status of promoter 在人体染色体DNA中， 主要是CpG中的C被甲基化 CpG island: CpG高频率出现的DNA区段 （200bp) Promoter区CpG island的高甲基化将抑制基因表达 理论上，基因组DNA中的CpG占总序列的6％， 但实测为1%, 称之为CpG抑制。 DNA 甲基化所需的酶： 维持甲基化： DNMT1 （DNA methyl-transferase 1) 基因甲基化状态可传递至子代细胞 (imprinting) 从头甲基化： DNMT3a or 3b CpG 甲基化对基因组的影响 DNA高度螺旋化、凝缩成团 排斥转录因子结合 失去某些酶切位点 基因失去转录活性 抑癌基因高甲基化： 肿瘤发生与发展 抑制DNA甲基化： 潜在的抗肿瘤治疗途径 MSP （Methylation specific PCR） James G. Herman and Yu Han Northern Blotting Assay For gene expression assay Southern EM， Detection of specific sequences among DNA fragments separatied by gel electrophoresis. J Mol Biol, 1975, 98:503-517 Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (12): 5350-5354, 1977 原理 ? ? Northern杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术, 主要用于在mRNA水平上分析特定基因的表达水平。 基本步骤： 1，从组织和细胞中分离纯化总RNA（mRNA)； 2，用琼脂糖凝胶电泳的方法将RNA按大小分离； 3，印迹法将分离后的RNA转移到固体支持膜上； 4，用同位素或非同位素标记的核酸探针与膜上的RNA杂交； 5，对杂交膜进行显影以确定目的RNA的存在及其含量。 制备RNA TRIZOL试剂法，该方法简便高效，已在各实验室中广泛使用。 测定浓度和纯度 OD260/OD280≥1.8（溶解TE中） OD260/OD280≥1.6 (溶解在H2O中) 1.5%甲醛变性agarose凝胶电泳 检测样品的质量 二．RNA的琼脂糖/甲醛凝胶电泳 三．RNA的印迹转膜 膜的选择: 1. 硝酸纤维素膜 有杂交背景低的优点，但硝酸纤维素膜易碎，不能以共价方式结合DNA分子, 结合RNA能力较弱，结合分子≧ 500bp； 2. 尼龙膜 尼龙膜的优点是有较高的韧性和能与DNA共价交联，结合分子≧50bp。 上行印迹转膜 下行印迹转膜 T4 DNA Kinase