73、浙科版选修1第1部分实验1大肠杆菌的培养和分离(金浩良).pptVIP

实验1大肠杆菌的培养和分离 即时反馈 * * 浙教版普通高中课程标准实验教科书 生物选修1第1部分 浙江省宁波市鄞州中学 金浩良 一、基础知识 指的是结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。如酵母、细菌、放线菌、霉菌、蓝细菌和病毒等。 蓝细菌 酵母菌 病毒 大肠杆菌 （一）微生物 大肠杆菌 革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌，在肠道中一般对人体无害，但也有一些菌株是对人体有害的，可以侵袭肠粘膜并产生毒素。但是，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌也是基因工程技术中被广泛采用的工具。它以分裂方式繁殖，分裂速度较快。 小资料：革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两大类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰氏阳性就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性则相反。这两种细菌的差别在于细胞壁的成分不同。 （二）培养基 由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。 LB（Luria-Bertani）液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取液5g/L，氯化钠10g/L。 LB（Luria-Bertani）固体培养基：50ml LB（Luria-Bertani）液体培养基中再加入1g琼脂制得。 （可用于大肠杆菌的扩大培养） （可用于大肠杆菌的划线分离） 通用的细菌培养基： （三）无菌技术 泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。 1、消毒： 是指杀灭大部分病原微生物的方法。 （1）100℃煮沸5-6min （2）巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min （3）用75%酒精等进行皮肤消毒 （4）紫外线消毒 常用消毒方法： （1）灼烧灭菌 2、灭菌： 是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞、孢子）的方法。 （2）干热灭菌： 160-170 ℃下加热1-2h。 （3）高压蒸气灭菌：100kPa、121 ℃下维持15-30min. 高压蒸汽灭菌锅 恒温干燥箱 二、大肠杆菌的培养和分离实验步骤 （一）培养基的制备与灭菌 取两个250ml的三角瓶，分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，用牛皮纸包装后放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。 LB液体培养基——细菌的扩大培养 LB固体培养基——细菌的划线分离 封口膜：既通气又不使菌进入 （二）倒平板 待灭菌后的固体培养基冷却到60℃时，在超净台上分别将培养基倒入4个培养皿中，每倒入一个培养皿后立即将培养皿置于水平位置上，并轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝固后形成平面。 无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒 操作时右手无名指和小指夹住封口膜，另外三指持三角瓶，左手拿培养皿并打开上盖的一边，在酒精灯火焰旁操作。 （三）大肠杆菌的接种 将斜面上培养的大肠杆菌菌种用接种环接种到灭菌后的LB液体培养基中，将三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。 注意事项: 1.在火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌，冷却后方能取菌； 3.接种时右手拿着接种环，右手无名指和小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜； 4.取菌后封口膜和棉塞复原. 三角瓶在37℃，每分钟200转的摇床上振荡培养12h。 （四）大肠杆菌的扩大培养 （五）大肠杆菌的划线分离 1、操作步骤 （1）灼烧接种环； （2）接种环冷却后，从在摇床上培养了12h的菌液中蘸取菌液； （3）在近火焰处，用带菌液接种环在固体培养基上划线。 划线分离、培养、菌种保存 划线后盖好培养皿，将培养皿倒置 在37 ℃恒温培养箱中培养12-24h 划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。 在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37 ℃培养24h后，置于4 ℃冰箱中保存。 2、问题讨论 （3）为什么每次划线之前都要灼烧接种环？ 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。 （1）在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 以免接种环温度太高，杀死菌种。 （2） 划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 课堂小结与作业布置