分离、纯化质粒DNA.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 变性的DNA与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来。 保留于上层水相的RNA，通过异丙醇沉淀与75%乙醇洗涤而制备。 四、商品化的单相裂解试剂法分RNA 目前，该法已成为实验室最常用的总RNA提取法，其产量及质量与前法相当。 Trizol 五、mRNA的分离纯化 除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3′末端带有长短不同的poly（A）尾巴。 利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA。 1. oligo（dT）-纤维素柱层析法 2. oligo（dT）-纤维素柱离心法 3. oligo（dT）-纤维素液相结合离心法 4. 磁性球珠分离法 （1）oligo(dT)-纤维素层析柱法 （2） oligo(dT)-纤维素液相结合离心法 （3）磁珠分离法 实验步骤 1 每mg组织中加入1mlTrizol试剂，高速破碎组织（使用高速组织捣碎器） 2 加入氯仿0.2ml,轻轻颠倒混匀，室温静置分层。 3. 高速离心12000rpm，4-8 °C ，10分钟 4.吸上清液至新离心管中，约600ul 5 加入500ul异丙醇，混匀，室温静置10分钟 6.高速离心12000rpm，4-8 °C ，10分钟 7.弃上清液，沉淀为RNA 8.加入1mlDEPC处理的75%乙醇，混匀，7500rpm离心， 4-8°C，5分钟 9.加入DEPC处理水30ul，混匀，55-60 °C水浴 10.3ul加入297ulDEPC水，测定浓度和纯度 RNA浓度（μg /ml）=A260×40 ×1/光径×稀释倍数 RNA纯度=A260/A280 比值为2.0表明RNA较纯 RNA鉴定 浓度鉴定 紫外吸光光度法: A260×稀释倍数×40＝ μg/ml (OD260-OD320)×稀释倍数×40＝ μg/ml 纯度鉴定 OD260/OD280 (1.8~2.0) Ratio1.8 : 蛋白质污染 Ratio2.2 : RNA可能已经水解成单核苷酸 注：测定吸光值，稀释液应使用ＴＥ ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 正常时，28S RNA的荧光强度约为18S RNA的2倍，否则提示RNA的降解 完整性鉴定： 如何避免ＲＮＡ含量较低？ ＯＤ２６０／ＯＤ２８０１.６５时可能存在的问题？ 　 核酸的贮存——RNA保存 RNA可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸水，在-70℃保存。 RNA可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在-20 ℃保存。 RNA如果以DEPC（焦碳酸二乙酯）可以抑制RNA酶对RNA的降解 * * * * * * * * * * * * * * * 由于条件温和，该法特别适用于大质粒DNA（15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。 （四）其它方法 2、牙签少量制备法 1、 小量一步提取法 1、 小量一步提取法 直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体DNA，最后从上清液中回收质粒DNA。本法简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析。 （二）牙签少量制备法 用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落制备质粒DNA。 由于制备的质粒DNA有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定。 质粒DNA的纯化 １.　CsCl-EB法 ２.　聚乙二醇沉淀法 ３.　柱层析法 EB—CsCl密度梯度离心法 EB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA结合EB浮力密度降低较小，仅有0.085g/cm3。 CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达100%。 超速离心将介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过量EB存在下，蛋白质的密度最小位于最上层；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中间，由于不同结构的DNA与EB结合度不一致，因此密度下降不一致，故将线性、开环、闭环的DNA区分开。 EB—CsCl密度梯度离心法示意图 l?转基因动