第二章 第一节基因操作的工具酶课件.pptVIP

大肠杆菌DNA聚合酶I （E。Coli DNA pol I）是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3 种不同的酶活力： 5′- 3′聚合酶活性 以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合到引物的3′-OH末端，并不断延伸。 5′- 3′外切酶活性 将双链DNA中游离的5′末端逐个切去。 3′ - 5′外切酶活性 将游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。 CCG GGCTATCGGA CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ A T A G CCT CCGATAGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ CCGATAGCCT GGCTA Pol I + Mg2+ T 大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途 A. 制备高比活度的DNA探针 利用其5′ 3′的外切酶活性及其聚合酶活性。 B. 用于DNA连接后的大缺口填充 利用5′ 3′的聚合酶活性。 C. 用于DNA的序列分析 利用5′ 3′的聚合酶活性。 大肠杆菌聚合酶I的应用示例 CCGATAGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ 切口平移 (Nick translation) CCG GGCTATCGGA CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ A T A G CCT 1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 3、T4 DNA聚合酶 4、逆转录酶（反转录酶） 三 DNA聚合酶及其应用 Klenow片段的主要用途 Klenow片段大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，它仍然有5′ 3′的聚合酶活性和3′ 5 ′的核酸外切酶活性，但失去了5′ 3′的外切酶活性。 Klenow片段的主要用途 修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端 标记DNA片段的末端 cDNA克隆中第二链cDNA的合成 DNA序列的测定 GAA CTTAA 1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 3、T4 、T7 DNA聚合酶 4、逆转录酶（反转录酶） 三 DNA聚合酶及其应用 T4、T7 DNA聚合酶的特点 T4 DNA聚合酶是从T4 噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，它和大肠杆菌聚合酶 I一样具有5′ 3′的聚合酶活性、 5′ 3′的外切酶活性和3 ′ 5 ′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高200倍。 T7 DNA聚合酶是从T7 噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的， T7 DNA聚合酶是所有DNA聚合酶中 持续合成能力最强的一种酶，其3 ′ 5 ′的核酸外切酶活性是Klenow DNA聚合酶的1000倍。 T7 DNA聚合酶可以替代T4 DNA聚合酶的功能并能用于大片断的扩增。 T4 DNA聚合酶的用途 1、以填充反应标记有5′端延伸的双链 DNA片段； 2、以取代反应标记延伸末端或平头末端 的双链DNA片段； 3、用于DNA序列分析； 耐热的DNA聚合酶 耐热的DNA聚合酶是在高温下具有活性的DNA聚合酶，来自嗜高温的细菌主要用于PCR反应，如Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等。 1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 3、T4 DNA聚合酶 4、逆转录酶（反转录酶） 三 DNA聚合酶及其应用 逆转录酶—Reverse transcriptase 逆转录酶是 一种可以有效地将mRNA转录成为DNA的酶，其产物称为cDNA (complementary DNA). 实际上，它也是一种RNA依赖的DNA聚合酶。 逆转录酶首先是1970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的《Nature》杂志上。 主要用途是 将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。 3’ AAAAAAAA AAAAAAAA 5’ TTTTTTTTT AAAAAAAA TTTTTTTTT 5’ TTTTTTTTT 3’ AAAAAAAA 第一节 基因操作的工具酶 一 限制性核酸内切酶及其应用 二 DNA连接酶及其应用 三 DNA聚合酶及其应用 四 修饰性工具酶 Genetic engineering is largely an exercise in