遗传工程和转基因技术 0801课件.pptVIP

DNA重组技术的应用 重组蛋白质的表达系统 克隆能编码特定蛋白质的基因或cDNA. 开发合适的表达系统 常用的表达系统 大肠杆菌　E.coli 枯草芽孢杆菌　Bacillus Subtilis 酵母 培养的昆虫细胞 哺乳动物细胞 选择表达系统，根椐所生产的蛋白质的性状确定。 细菌细胞 优越性　 操作方便 细菌繁殖快 可获得大量蛋白质且价格低廉 缺点　 多肽成份常不能适当的折叠，常形成不溶性包涵体。而从包涵体中制备的蛋白质常无生物活性。 菌体因产生的大量异体蛋白，而对细菌产生毒性副作用，而使细菌培养物中细菌的浓度不高。 细菌缺乏转录后修饰的酶，如在蛋白质上加上磷酸根，糖基。而这些修饰作用对蛋白质完成其功能常常是必须的。 酵母细胞 优越性 为十分简单的真核细胞，其特性和哺乳动物细胞相似，而其生长和细菌一样快。 可完成人类蛋白质的转录后修饰。并可诱导表达蛋白分泌至培养基中。 缺点　　 其有活性的蛋白水解酶类，可降解异体蛋白，使其产量降低。 昆虫细胞 利用昆虫病毒，杆状病毒在昆虫细胞中表达异体蛋白质。 优越性　 1.蛋白能高水平表达，多肽能正确折叠。 2.具有转录后修饰作用。 缺点　 昆虫细胞培养价格高于细菌和酵母 哺乳动物细胞 生产哺乳动物蛋白质的最佳表达系统。 启动子，载体，转染方法 在哺乳动物细胞稳定组入扩增基因，可供产生大量蛋白 缺点 细胞培养价格高于细菌和酵母和昆虫细胞。 克隆载体 克隆质粒载体 基因克隆的目的不仅是为了获得大量的克隆在载体上的DNA 片段，而且还要考虑后续实验如测序，表达，突变的要求。 pGEM-T和pGEM-T Easy载体 PCR扩增中常用的DNA聚合酶Taq DNA聚合酶可以不需要模板在PCR产物上加一个A，一些生物公司根据这一特点研究制了T载体。 在pGEM-T载体的两边还分别有一个限制性内切酶BstZ I的识别位点，如果在外源DNA片段上没有该酶的识别位点，只用该酶就可以将外源基因完整的切下来，根据酶切片段的大小对重组质粒进行签定。在pGEM-T Easy质粒的插入点两边，增加了EcoR I和Not I酶切位点，使外源DNA片段的鉴定更加容易。 表达质粒载体 原核表达质粒载通常须具有一个强的启动子，一个位于启动子和起始密码子ATG之间的核糖体结合序列以及位于外源基因插入序列下游的转录终止序列。 原核表达载体常用的启动子 lac启动子 较早使用的启动子，来自大肠杆菌的乳糖操纵子，常用IPTG诱导，启动外源基因的表达。 trp启动子 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，表达载体上的启动子常常包含操纵子的启动基因，操纵基因和部分trpE基因，删除了衰减子序列，在β-吲哚丙氨酸的诱导下，转录水平比大肠杆菌中的正常启动子提高8到10倍。 tac启动子 是一组由lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，但仍可以用IPTG诱导，tac是一个非常强的启动子，由tac启动子启动的基因的转录水平比lac和trp启动子高。 PL启动子 来自λ噬菌体，也是一个非常强的启动子。 受λ噬菌体阻遏基因cI编码的阻遏蛋白的控制，表达载体的宿主菌带有一个cI基因温度敏感突变体，它表达的阻遏蛋白在28～30℃才有活性，能够阻抑启动子的表达；当温度提高到42℃时，它的表达产物失去活性，启动子能够转录外源基因。这种温度诱导的特性是以PL为表达载体的一大优点。 T7启动子 来自于T7噬菌体，有该启动子并在T7 RNA聚合酶驱动下表达外源基因的大肠杆菌质粒称为pET表达载体家族。 T7噬菌体RNA聚合酶不仅能够选择性的与T7启动子结合，而且在不降低启动效率的前题下，其沿DNA模板合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5 倍，因此提高了对外源基因的转录水平。 pET表达系统表达外原蛋白必须使用特殊的大肠杆菌受体菌，如BL21和HNS174。 这些菌株是λ噬菌体的溶源衍生菌，其染色体上含有PlacUV5启动子控制下的T7 RNA聚合酶基因。 pET表达系统是一个基因表达的级联反应，IPTG首先诱导 PlacUV5启动子表达T7 RNA聚合酶，T7 RNA聚合酶再选择性的结合T7启动子启动外源基因的转录。 pcDNA3.1/His表达载体 pCDNA3.1/His表达载体是Invitrogen公司的产品，载体采用人巨细胞病毒的立即早期启动子，用来在哺乳动物细胞内获得高表达的外源基因及进行基因功能的研究。 pCDNA3.1/His载体是一种穿梭质粒表达载体，带有pUC质粒的复制起点和ampr基因，可以在大肠杆菌内扩增和选择重组转化子，同时载有SV40的复制起点