实验五3,5二硝基水杨酸法测定蔗糖酶活力.pptVIP

实验五 蔗糖酶的活力测定 实验目的： 掌握3,5二硝基水杨酸测定还原糖的原理和方法 掌握酶的活力测定及其计算方法 实验原理： 蔗糖酶是一种水解酶，它催化蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。 本实验利用3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物。在一定浓度范围内，还原糖的量与棕色物质颜色深浅程度成一定比例关系，可用分光光度计进行测定。 酶活力单位：在35℃，0.1mol/L乙酸钠缓冲液（pH4.6）中每分钟能使2.5%蔗糖溶液释放1 mg还原糖的酶量定义为一个活力单位（U）。 试剂与器材 蔗糖酶溶液 5%的蔗糖溶液 DNS试剂（3,5二硝基水杨酸试剂） 1mg/ml的葡萄糖标准液 器材 微量移液器 移液管 刻度试管 水浴锅 分光光度计 比色杯 卫生纸 操作步骤 1.葡萄糖标准曲线的制作 以葡萄糖（mg）含量为横坐标，A540值为纵坐标，绘出工作曲线。 制作工作曲线的注意事项 1.分光光度计的使用 测样时，光吸收值A应在0.1~0.8之间，否则，缩小或加大样品的稀释倍数，重测！ 2.比色杯的使用： 向杯中加样品时，注意加样到比色杯的2/3处； 如样品外溢，用卫生纸向一个方向擦至透明； 测定样品时，从浓度低到高测定； 测定完成后，一定用洗瓶中的蒸馏水洗干净,然后倒置在滤纸上吸干； 任何情况下都不许把比色杯放在仪器盖上! 2.蔗糖酶的活力测定 取两只试管，各加入0.5ml酶液，其中一支试管A置于100℃沸水浴2min（做参比），另一支试管B做测定管； 然后在两支试管各加入0.5ml 5%的蔗糖液，置于35℃水浴，准确计算反应时间10min，然后取出各加入1mlDNS溶液终止反应； 再置于沸水中水浴5min，取出冷却后定容至10ml测定540nm吸光值。 3.蔗糖酶活力的计算 （1）获得葡萄糖标准曲线： y=ax+b x=（y-b）/a 蔗糖酶活力=x*n/0.5*10 (单位：U/ml） n：稀释倍数 0.5：0.5ml酶液 10：10 min 实验结果 绘制标准曲线 计算蔗糖酶活力 * * 试剂 A540 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 葡萄糖含量/mg 定容至10ml 蒸馏水/ml 沸水浴中煮沸5min，取出，冷却至室温 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 DNS试剂/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 标准葡糖溶液/ml 5 4 3 2 1 0 管号 试剂 酶活力单位：在35℃，0.1mol/L乙酸钠缓冲液（pH4.6）每分钟能使2.5%蔗糖溶液释放1 mg还原糖的酶量定义为一个活力单位（U）。 *