转座子插入敲除.pptxVIP

转座子(transposon)是存在于DNA上可自主复制和移位的基本单位。由Barbara McClintock 在20世纪40年代首次从玉米中发现，从此改变了人们对基因组序列稳定性的认识，打破了遗传物质在染色体上呈线性固定排的传统理论。1983年McClintock因发现转座子被授予诺贝尔奖特点：1、所有生物的染色体都有转座子2、转座相关序列可以占据物种基因的很大一部分，如人和玉米基因组的50%以上是由转座相关序列组成3、转座子的含量在不同基因组中变化很大4、当转座子移位时，转座因子通常对插入位点几乎没有序列选择性转座子类型：1、DNA转座子2、类病毒反转录转座子3、聚腺苷酸（poly-A）反转录转座子转座机制：1、剪切-粘贴机制2、复制-粘贴机制插入突变转座子插入突变是利用转座子在染色体上可移动的特点，当其跳跃插入到某个功能基因内部或邻近位点时时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型。因此我们可以利用某些能随机插入基因序列的转座子，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记（如Tn5转座子含kan抗性基因）进行筛选获得相应的基因敲除细胞。 睡美人转座子(sleeping bueaty,转座子SB)已证明在小鼠和人细胞中可以激活,转座子插入新的位点后，该位点附近的基因即受到抑制呈现隐性的“睡美人”表型。一旦转座子在转座酶的作用下从这一位点上转走，该位点的基因隐性表型又恢复为显性表型，即“睡美人苏醒”。调控转座酶和转座子活性的系统称为青蛙王子(Frog Prince)。用特异的开放阅读框捕获技术，可以使自然散在的转座酶编码基因高表达，人为催化激活转座子使其苏醒，执行插入、切除等任务。目前已经应用于微生物、昆虫、植物、动物及人类基因组功能的研究。例如蛙类基因组含有Tcl水手转座子超家族，呈自然失活状态，转座酶与转座增强子序列末端结合,在HMGBI蛋白协助下，激活转座子，使睡美人转座子苏醒。使用转座子进行插入突变的优点有：（1 ）转座子能够在转座酶的存在下从插入位点剪切下来，造成突变体反转。采用这种方法可进一步确证突变体表型是否由转座子插入突变引起。（2）大多数转座的位点偏好于连锁位点，所以如果有一个可转座的元件靠近目的基因，那么可转座的元件即会高效地移动并插入目的基因。因此，即使在突变体库中没有发现期望的插入位点，仍可以采用转座子在连锁位点上的转座获得目的基因被插入失活的品系。（3 ）当一个基因家族的多个成员沿染色体串连排列时，可采用复制型的转座系统创建该基因家族全部成员均被敲除的突变体。随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因包括：一方面，许多基因在功能上是冗余的，敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能；另一方面，对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究了