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基因组DNA的鉴定 PCR产物鉴定 琼脂糖凝胶电泳 目的要求 掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸原理及方法； 掌握荧光染料使DNA染色原理； 掌握电泳结果观察分析方法。 实验原理 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定核酸最常用的方法，在pH8.0的缓冲液中，核酸带负电荷，在电场中向正极移动，由于分子筛效应，可将分子大小和构象不同的核酸分子分离，不同浓度的凝胶可分离不同分子大小的DNA片段。 荧光染色原理 核酸的荧光染料如溴化乙锭（EB)、SyberGreen等嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在 UV 激发下发出荧光。荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。 *SYBR Green I具有双链DNA的专一选择性；EB则与单链、双链甚至三链DNA均可高效结合。 紫外投射分析仪： 本实验所用上样缓冲液包含二甲苯青（相应于2KbpDNA）和溴酚蓝（相应于20bpDNA）两种染料，也称示踪剂。 操作步骤 8uLPCR产物(基因组DNA) + 2uL SyberGreen 混合 +2uL上样缓冲液（含指示剂、甘油、巯基乙醇等） 取其中10uL上样于1%琼脂糖凝胶加样孔 100V恒压电泳至指示剂到凝胶2/3处停止电泳 紫外灯下观察电泳结果 画出示意图并分析电泳结果 Marker 图谱 DNA Marker (DL2000) 思考题 1. 怎样用电泳法测定未知DNA片段的分子量？ 2. 为什么相同大小的DNA片段在不同组电泳结果上显示细小的迁移率差异？ 3. 基因组DNA在扩增前后电泳结果有什么区别？ * * * * * * - + 琼脂糖浓度与分离线状DNA的有效范围 琼脂糖含量(%) 分离线状DNA的有效范围(kb) 0.5 1-30 0.7 0.8-12 1.0 0.5-10 1.2 0.4-7 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 SYBR Green I 工作原理 SYBR GreenI 能结合到双链DNA的小沟部位 紫外灯下发出荧光 SYBR Green EB与DNA的结合 三、核酸的鉴定与保存 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 系 统 凝 胶 成 像 系 统 凝胶成像系统观察核酸电泳产物 基因组DNA鉴定 M - PCR * * *
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