5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段概论.pptVIP

温故知新1: 1:组成DNA分子的基本单位是什么? 2:这些基本单位是如何连接成DNA分子的? 3:DNA分子结构有什么特点？ 1、 PCR（多聚酶链式反应）技术： * * 多聚酶链式反应扩增DNA片段 脱氧核苷酸 脱氧核苷 磷酸 脱氧核糖 含氮碱基 嘌呤 嘧啶 腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C） 胸腺嘧啶（T） 1 2 3 4 5 碱基 OH O O P O HO OH O O P O HO 碱基 OH OH 1 5 2 4 3 O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱基 脱氧核糖 5’ 3’ 脱氧核苷酸链结构简图 磷酸二酯键 DNA分子的平面结构 A T G C A G C T 氢键 5端 3端 5端 3端 识别 ： DNA分子的3′ 端与5′ 端 -OH端为3′; 磷酸基团的末端为5′。 有几个游离的磷酸基团？ 1:DNA分子的复制过程是怎样的？ 2:DNA分子的复制需要哪些条件？ 温故知新2 解旋、合成子链、复旋 1:解旋酶： 打开DNA双链 2:DNA母链： 提供复制的模板 3:4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 4:DNA聚合酶： 催化合成DNA子链 5:ATP： 为复制过程提供能量 6:引物： 使DNA聚合酶从引物的3′端开始 连接脱氧核苷酸(一小段RNA) DNA复制的条件 模板 原料 酶 能量 一、基础知识 (一）PCR原理 利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。 2、原理： DNA复制的条件 DNA母链：提供复制的模板 解旋酶： 打开DNA双链 4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 DNA聚合酶： 催化合成DNA子链 ATP：为复制过程提供能量 引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连 接脱氧核苷酸(一小段RNA) 3、PCR反应的条件 80—100℃： 耐热的DNA聚合酶： 缓冲溶液：维持反应的pH值不变 (一般是一小段单链DNA) 变性 复性(退火) 延伸 加热到95℃，DNA双链 解旋为单链 降到55℃，引物通过碱基 互补配对与单链DNA结合 升温到72℃，四种脱氧核苷酸 在DNA聚合酶的作用下，根据 碱基互补配对原则合成新的DNA链 (二)PCR反应的过程 PCR 循环第一步 ：加热变性: 双链DNA解聚成为单链 模板序列 模板序列 引物 Ⅰ 引物 Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ PCR 循环第二步 ：引物与模板序列复性（退火）: 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 模板序列 模板序列 引物Ⅰ 引物Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA 聚合酶 PCR 循环第三步 ：引物延伸: 合成新的DNA链 模板序列 模板序列 第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列 1,048,576 20 1,073,741,824 30 8 3 4 2 2 1 DNA数量 循环次数 30次循环后扩增的数量 4、PCR 循环的结果 ② DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 ①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。 第一轮结果 1 2 3 4 1 2 3 4 第二轮结果 72℃，1min 55℃，30s 95℃，1min 最后一次 72℃，1min 55℃，30s 95℃，30s 30次 － － 95℃，5min 预变性 延伸 复性 变性 循环数 二、 实验操作 1、PCR仪 （一）设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器。 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml。 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。 PCR仪 微量离心管 微量移液器 1、准备 2、移液 （二）实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上 用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂 ①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。 ②注意： 3、混合 B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。 A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。 将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。 ①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。 4、离心 5、反应 ②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。 *