第02章核酸化学2解说.ppt

二、DNA的变性(denaturation) 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。 变性后其它理化性质变化： OD260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失 目 录 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 例：变性引起紫外吸收值的改变 DNA的紫外吸收光谱 增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。 目 录 热变性 解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。 目 录 Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(melting temperature, Tm)。其大小与G+C含量成正比。 目 录 爆发式：热变性是在变性温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到熔点时的熔化现象，故名熔解温度 狭窄性：变性温度范围很小 变性温度的特点 DNA的Tm值大小与下列因素有关： （１）DNA的均一性均一性愈高的样品，熔解过程愈是发生在一个很小的温度范围内。 （２）G—C之含量G—C含量越高，Tm值越高，成正比关系，这是G—C对比A—-T对更为稳定的缘故。所以测定Tm值可推算出G—C对的含量。其经验公式为：G—C（％）＝（Tm－69.3）×2.44 （３）介质中的离子强度一般说来，在离子强度较低的介质中，DNA的熔解温度较低，熔解温度的范围也较窄。而在较高的离子强度的介质中，情况则相反。所以DNA制品应保存在较高浓度的缓冲液中或溶液中，故常在1 mol／L的NaCl中保存。 （4）变性剂 尿素、甲酰胺等RNA分子中有局部的双螺旋区，所以RNA也可发生变性，但Tm值较低，变性曲线也不那么陡。 三、DNA的复性与分子杂交DNA复性(renaturation)的定义 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。 减色效应 DNA复性时，其溶液OD260降低。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。 目 录 在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。 核酸分子杂交(hybridization) 核酸的分子杂交 核酸分子杂交的应用 研究DNA分子中某一种基因的位置 定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础 * * 核酸（DNA和RNA）是一种线性多聚核苷酸，它的基本结构单元是核苷酸。 核苷酸本身由核苷和磷酸组成, 而核苷则由戊糖和碱基形成 * 核酸中的碱基有两大类：嘌呤碱和嘧啶碱。它们是含N的杂环化合物，呈弱碱性，故称为碱基，亦称含N碱。 * （四）核苷酸的生物学作用 （1）参与DNA、RNA的合成、蛋白质的合成、糖与磷脂的合成。 （2）在能量转化中起重要作用，ATP是生物体内能量的通用货币。 （3）是构成多种辅酶的成分：NAD、NADP、FAD、FMN和CoA。 （4）参与细胞中的代谢与调节（cAMP、cGMP）。 * 1、天然状态的水溶液中的DNA为B-DNA，若降低湿度或在水溶液中加入乙醇，可使B-DNA变成A-DNA. 2、天然DNA中有Z-型构象存在，B-DNA与Z-DNA可相互转变，并处于某种平衡状态，一旦破坏这种平衡，基因表达可能失控，所以推测Z-DNA可能和基因表达的调控有关。 3、由于第三条链的胞嘧啶被质子化（H+）化才能参与配对，故又称H-DNA.它跟双螺旋结构相似，都是通过DNA单链之间形成氢键来实现的。 4、DNA的三螺旋结构与双螺旋结构相似，都是通过DNA单链之间形成氢键实现的。其特点： （1）组成三螺旋的DNA单链，一般都是由单一的嘌呤或单一的嘧啶碱基所组成。 （2）DNA三螺旋的基本结构有两种，一种是由两条多聚嘧啶碱基核苷酸链和一条多聚嘌呤碱基核苷酸链组成 ，即嘧啶—嘌呤—嘧啶。三条链中碱基形成氢键的情况是，T-A-T,C-G-C。第二种是由两条多聚嘌呤碱基核苷酸链和一条多聚嘧啶碱基核苷酸链组成，简单表示为嘌呤—嘌呤—嘧啶。三条链中碱基形成氢键的情况是：A-A-T,G-G-C。上述两种结构中，中间的碱基必须是嘌呤碱基。 （3）