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张宪省课题组原位杂交实验方法 （山东农业大学作物生物学国家重点实验室 中国山东泰安 271018） 2.2.15 原位杂交 2.2.15.1 材料的固定 将材料浸入20倍于材料的FAA固定液（50% 乙醇: 10% 冰醋酸: 5% 甲醛）中，抽气除去材料表面附着的气泡直至材料沉于容器底部，4℃过夜。 2.2.15.2 材料的包埋 （1）脱水 材料经50%、70%、80%、95%、100%、100%、100%乙醇脱水，每一级乙醇60分钟。 （2）透明 依次经25%二甲苯－75%乙醇、50%二甲苯－50%乙醇、75%二甲苯－25%乙醇、90%二甲苯-10%氯仿、90%二甲苯-10%氯仿，每步30分钟。 （3）浸蜡 50%石蜡－50%二甲苯，42℃烘箱中放置4-16小时，移入60℃烘箱，更换为100％石蜡（Promega公司产品），保温两天，期间更换4次纯石蜡。 （4）包埋 将浸过石蜡的实验材料包埋在100％石蜡中。 2.2.15.3 切片 （1）载玻片（Poly-Prep? slides）购自美国Sigma公司。 （2）将包有实验材料的蜡块按照实际要求修整好，然后用切片机（American Opitcal 820 Rotary, 美国）将实验材料切成8 μm厚的蜡带，再将合适的蜡带平整地铺到载玻片上。 （3）42℃展片台上充分展片，然后置于42℃烘箱中粘片约48小时，4℃保存。 2.2.15.4 探针标记 1 转录模板的制备 设计特异引物SHB1-F，SHB1-R1和SHB1-R2，经PCR扩增出SHB1的5′ 端 379bp的非保守序列，PCR反应程序如下：94℃预变性3分钟，然后进行以下循环，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行32个循环。最后72℃延伸10分钟。将PCR产物连接到pGEM-T easy 载体上，再进行大肠杆菌转化，并进行序列测定。挑选目的克隆于50 mL LB液体培养基（含50 mg/L Amp）中，37℃ 200 rpm过夜，待菌液浓度约为5.0A 600U/mL时可以提取质粒。利用2.2.7所示方法提取质粒DNA。 2 转录模板线性化 先取少量的质粒溶液，用限制性内切酶NcoI和SpeI进行酶切，酶切反应在37℃水浴中进行3小时，电泳检测线性化是否完全。如果线性化完全，就可以大量酶切模板，一般每管选用50-80 (L体系，共酶切四管。 3 转录模板的纯化 将四管酶切产物合并到一起，用DEPC′ddH2O将总体积补到600 (L。 （a）加入等体积的苯酚/氯仿（25：24），振荡器振荡10分钟，充分混匀，12,000rpm离心5分钟，取水相； （b）再加入等体积的氯仿，振荡器充分振荡混匀，12,000rpm离心5分钟，取水相；重复一次氯仿抽提，将水相转移到新的离心管中。 （c）加入1/10体积的NaAc（3M，PH5.2）和2倍体积冰预冷的无水乙醇，-20℃放置2小时以上沉淀模板。 （d）12,000rpm离心10分钟，吸弃上清，加入1 mL预冷的70%乙醇，用移液器轻轻将沉淀块整块打起，12,000rpm离心2分钟，用移液器轻轻吸走乙醇，再加入预冷的200 (L无水乙醇，13,000rpm离心2分钟。 （e）用真空泵将管壁上的液体吸干，在37℃烘箱烘干5分钟，用适当体积的灭菌ddH2O溶解沉淀。 （f）取1(L上述模板溶液进行电泳检测，用2000Marker作为对照，粗略估计模板的浓度（至少为1 (g/13(L）。 4 转录反应 （1）转录体系 以纯化的线性化产物为模板分别在SP6与T7 RNA聚合酶的作用下合成反义和正义探针，具体操作参照Roche公司DIG-RNA Labeling Kit说明书。反应体系如下所示。置于37℃，水浴2小时。 RNA聚合酶 SP6 T7 DEPC′ddH2O＋线性化模板 13.0 (L 13.0 (L 10( Transcription buffer 02.0 (L 02.0 (L 10( NTP labeling mixture 02.0 (L 02.0 (L RNase inhibitor 01.0 (L 01.0 (L RNase聚合酶 02.0 (L 02.0 (L 总体积 20.0 (L 20.0 (L （2）加2 (L RNase-free DNaseI，置于37℃水浴中反应15分钟以去除DNA模板。另加0.8 (L 0.5M EDTA（PH8.0）中止反应。 （3）收集探针，在20 (L标记体系中加入 10 mg/mL tRNA 1.0 (L 4 M LiCl 2.5 (L