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质 粒 抽 提 陈继胜 ★质粒的重要性 质粒是宿主细胞引入外源基因的主要方法! 质粒是下游生物技术(如蛋白表达,药物筛选,细胞和组织研究)的基础!质粒的结构影响下游实验的成功率,特别是涉及到蛋白和基因的相互作用时! 质粒是我们发给客户的最终产品! ★质粒抽提的方法 碱裂解法抽提质粒 煮沸法快速提取质粒 ★碱裂解法抽提质粒的原理: 在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后再进一步纯化质粒DNA。 首先以Axygen小抽试剂盒介绍一下试剂的成分: 溶液I: 50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA， pH 8.0；RNAse; 溶液II:0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III:3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸; Wash solution W1:Proteinse K; Wash solution W2:乙醇; 溶液I的作用 首先要控制溶液的pH，因此用适当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液，50?mM葡萄糖起到使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,主要作用是：抑制DNase的活性。在溶液I中加入达?10?mM?的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。 溶液II作用 用新鲜的0.4?N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH。破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳?的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4?N?NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合,不然基因组DNA也会断裂。 溶液III 溶液III加入后就会有大量的沉淀。沉淀是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质还有基因组DNA。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。中和后的离心去蛋白 - 一定要将蛋白质彻底离心下去。如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面，继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中，再离心，效果要好许多。 ★氨基化二氧化硅晶体粉末吸附法 由于表面氨基化使纳米颗粒在一定的pH环境下的ζ(zeta)电位为正值，与带负电荷的质粒DNA通过静电结合能快速形成纳米颗粒-质粒DNA复合物，并对结合的DNA有明显的保护作用 ★苯酚/氯仿分离蛋白质和核酸法 　　按氯仿:异戊醇＝24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。 　　 按体积/体积＝1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。 ★苯酚/氯仿分离蛋白质和核酸法 1.加等量的酚/氯仿混合液振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 2.取上层溶液至另一管，加入等体积的酚/氯仿混合液，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 3. 取上层溶液至另一管，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。 4.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 5.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。 6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。 7.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。 8.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。 酚和氯仿的各自作用 酚（Phenol）对蛋