实验5 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血红蛋白-20151102.ppt

6. 样品的处理及加样 作为分析用的加样量仅需几微克 取100 uL样品，用样品溶解液稀释至1 mL（已制备好） 样品溶解液：40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01M pH6.7 Tris-HCl 缓冲液 用微量进样器取20 ?L上述混合液，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。注射器不可过低，以防刺破胶体，也不可过高, 在样下沉时会发生扩散。 每小组作3个样品： 纯化后的血红蛋白 BSA 蛋白Marker 5个小组用两个电泳板 7 .电泳 将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接。（红连红，黑连黑） 打开电泳仪开关，将电压调至最大，调整开始时电流为15 - 20 mA，待样品进入分离胶后，将电流调至30 - 40 mA， 当溴酚蓝染料距硅胶框1cm时，停止电泳，关闭电源。 Buffer + - 浓缩胶 分离胶 溴酚蓝 2个电泳板用一个电泳槽 * 8.染色与脱色 电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用塑料铲撬开短玻璃板， 从凝胶板上切下一角作为加样标记。 加入染色液，置于40oC烘箱染色20min（凝胶上应有隐约的蓝色带）。染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再加入脱色液，置于40oC烘箱脱色0.5-1h（直至蛋白质区带清晰），即可观察结果及计算相对迁移率。 9. 结果处理 观察记录电泳结果 量出加样端距溴酚兰的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR: 相对迁移率mR= 蛋白质样品距加样端迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm) 溴酚兰 * 蛋白Marker 六、注意事项 （1）灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。 （2）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。 （3）如加样孔界限不是很清晰，可在样品梳取出前用记号笔做上记号。 （4）电泳仪不能空载。 （5）电泳时不要用手接触电极缓冲液。 * 七、思考题 为什么要在样品中加少许溴酚兰和一定浓度的蔗糖溶液？蔗糖及溴酚兰的作用分别是什么？ * * * 一、目的要求 1. 学习电泳原理和技术 2. 学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离鉴定蛋白质技术 * 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。 电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽） 电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳等。 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移，分离成一个个独立的区带。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。 区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。 二、定义与分类 * 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 * 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝胶特点： 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定， 对pH和温度变化较稳定； 无吸附和电渗作用， 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。 * 根据介质是否均一，可分为连续电泳和不连续电泳 移动方向：带电性质决定。蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。一般说来，在碱性溶液中（即溶液的pH值大于等电点pI），分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动。 不同的质点在同一电场中泳动速度不同，常用泳动度（或迁移率）来表示。 泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。 三、原理 * * 影响泳动度的因素： 1 颗粒本身：主要取决于带电质点的性质，即颗粒所带净电荷的量、质点的大小和质点的形状。一般来说，质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。 2 外界因素：电