Genomics第4章.ppt

STS含量作图 对克隆文库中的每一个克隆都进行STS特异的PCR，那么能够得到PCR产物的所有克隆必定都含有重叠的插入片段。 4.2.3 全基因组鸟枪法测序 传统鸟枪法测序是细菌基因组测序的标准方法，该方法不需要提前了解基因组的信息。 该方法对大的真核基因组测序是很复杂的，由于重复DNA序列的存在会导致基因组片段的不正确组装。 全基因组鸟枪法测序是由 Craig Venter提出的，作为一种能加快速度获得大基因组序列的方法。该方法采纳了传统鸟枪法但借助于基因组图谱来保证序列的正确组装。 1. 全基因组鸟枪法测序的主要特征 为了使需要封闭的间隙数量降到最低，全基因组鸟枪法最少利用了两个用不同类型载体构建的克隆文库。 由于不相容性问题使某些片段的载体不能进行繁殖。不同类型的载体存在不同的问题，因此不能被克隆到一种载体中的片段，如果使用另一种载体的话就经常能被克隆。 为了避免重复元件所引起的错误组装，确保其中一个克隆文库中包含的片段长于所研究基因组中最长的重复序列，而且插入片段的两末端在主要序列中位于它们的正确位置上。 应用全基因组鸟枪法可避免错误 在全基因组鸟枪法中，通过确保被克隆的DNA片段的两末端序列都出现在主要序列中它们的预期位置上来避免这种错误。如果缺失了一个末端，那么在组装序列时就出现了错误。 序列组装的最初结果是一系列骨架（scaffold），每个骨架包括一组被序列间隙分开的序列重叠群。 每条骨架的标记被用来确定它在基因组图谱中的位置。如，如果STS在基因组图片上的位置已知，那么就可以通过确定骨架上含有哪种STS来对骨架进行定位。 全基因组鸟枪法组装序列的最初结果 骨架在全基因组鸟枪法组装序列中作为媒介。图中表示出两种骨架。每种骨架包括一系列被序列间隙分开的序列重叠群，骨架本身被物理间隙分开。 全基因组鸟枪法在果蝇和人类基因组中的应用已经证明了它的可行性，比重叠群克隆法更快速，但可能达不到预期的准确程度。 4.3 人类基因组计划 为了对作图和测序工作进行总结，我们将关注这些技术是如何应用于人类基因组的。 4.3.1 人类基因组计划的绘图阶段 (1) 遗传图谱 第一个人类遗传图谱是RFLP图谱，于1987年发布，包括393个RFLP和另外10个多态性标记。平均密度为10Mb一个标记。 1994年图谱包括5800个标记，其中超过4000个事SSLP，它的密度是每0.7Mb一个标记。 后来的版本在94年图谱上又加了另外的1250个SSLP。 （2）物理图谱 物理图谱方面主要成就是发表了全基因组YAC重叠群图谱，包括33000个含有平均大小为0.9Mb片段的YAC。 当认识到YAC克隆可能包括两个或多个非连续DNA片段时，便开始怀疑YAC重叠群图谱的价值。 一些YAC克隆包括来自人类基因组不同部位的DNA片段 这些问题使人们开始采用STS标记物的放射杂交图谱，1995年发布人类STS图谱，此图谱包括15086个标记物，平均密度为每199kb有1个标记。后来，该图谱又补充了另外20104个STS，平均每100kb有一个标记物。 STS图谱包括将近7000多个多态性SSLP的定位，这些SSLP已经通过遗传学方法进行了定位。结果是，遗传图和物理图就可以直接进行比较，最后产生一个综合、集成的图谱，该图谱可用作人类基因组计划DNA测序阶段的框架。 4.3.2 人类基因组测序 （1）BAC克隆重叠群法 构建了包含300000个BAC克隆的文库，并且已将这些克隆定位在基因组中，就形成了“序列准备图”。每个BAC克隆中的插入片段可以通过鸟枪法进行完全测序。 （2）全基因组鸟枪法 当克隆重叠群测序正在进行的时候，第一次提出了将全基因组鸟枪法作为一种替换方案取代目前一直采用的更加费力的克隆重叠群法。 首个全人类染色体（22号）的草图序列在1999年12月发表。 在2000年6月26日，美国总统与两个计划领导人联合宣布人类基因组计划工作草图完成。 焦磷酸测序 每种脱氧核苷酸分别加入，如果脱氧核苷酸未掺入到正在合成的链中，就被反应体系中的核苷酸酶降解。通过从脱氧核苷酸上释放的焦磷酸所引起的化学发光来检测核苷酸的掺入。 当然，如果4种脱氧核苷酸都是立刻加入的话，就一直会看见闪烁光，不会得到有用的信息。因此，每个脱氧核苷酸都是一个接一个地单独加入的，反应混合物中也存在核苷酸酶，以便如果一个脱氧核苷酸没有被掺入到多聚核苷酸中，那么在加入下一个核苷酸之前它就会被迅速降解。 4.1 DNA测序方法学 4.2 连续DNA序列的组装 4.3 人类基因组计划 如何将测序得到的大量短序列拼接成长的染色体序列？ 较短的原核生物基因组可通过鸟枪法组装起来。现在已经运用该方法拼接成2