抗肿瘤药物研究及新药筛选.ppt

抗肿瘤药物研究及新药筛选 赵万洲 博士 南京凯基生物科技发展有限公司 2009.10.30 化疗药物的发展 近代肿瘤化疗学始于20世纪40年代。 50年代通过动物筛选化疗药物发现了5FU、MTX、CTX等，化疗学有了发展。 60年代认识到肿瘤细胞动力学及化疗药药代动力学的重要性。大部分目前所用的抗癌药已发现，有急淋、HD、睾丸癌等可化疗治愈。 70年代形成肿瘤内科学，更多肿瘤有了比较成熟的化疗方案。 80年代研究以生物反应修饰剂等药物来提高化疗疗效，探索抗药性产生的原因，5%肿瘤患者可治愈。 90年代新抗癌药进入临床，多药耐药基因发现，生物治疗，基因治疗辅助治疗改善等，疗效进一步提高。 How many drug targets are there? ~8,000 targets of pharmacological interest, of which nearly 5,000 could be potentially hit by traditional drug substances, nearly 2,400 by antibodies and ~800 by protein pharmaceuticals. 抗肿瘤药物的筛选和评价 抗肿瘤药的临床前药理研究包括药效学和毒性研究两部分 抗肿瘤药物药效学需研究内容： 体外抗肿瘤试验 体内抗肿瘤试验评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。 体外抗肿瘤活性试验 目的： 对候选化合物进行初步筛选； 了解候选化合物的抗瘤谱； 为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等 。 体外抗肿瘤活性试验常用方法 体外试验常用方法有： 染料排斥法 四氮唑盐还原法 阿拉马蓝法 磺酰罗丹明染色法 集落形成法 生长曲线测定法。 药物与细胞共培养时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照 体外抗肿瘤活性试验常用方法 染料排斥法（dye exclusion assay） 试验原理：活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料，一定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比例。 方法要点：向一定容积的待检细胞悬液加入定量的某种染液，最常用的是0.4%台盼蓝液，混匀，室温染色5-15min，将已染色的细胞悬液滴加至血细胞计数板，直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数。 观测指标：按（未染色细胞数/细胞总数）X100%计算活细胞率，对照组活细胞率应在90%以上。根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量（IC50）作为药物抗肿瘤活性的指标。 体外抗肿瘤活性试验常用方法 阿拉马蓝法（alamar blue assay） 试验原理：非荧光性蓝色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内的NADPH相关的脱氢酶类还原为强荧光性粉红色底物，采用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm和590nm处读取荧光强度值，与活细胞数呈良好的线性关系。 方法要点：细胞经受试样品处理后，加入10-20ul阿拉马蓝染液，继续培养一定时间，用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm和590nm处读取荧光强度值。 观测指标：根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率，适当时可进一步计算IC50值。 体外抗肿瘤活性试验常用方法 集落形成法（clonogenic assay） 试验原理：克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂6代或6代以上时，其后代所组成的群体(集落)便含50个以上细胞。通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被认为是一种较理想的检测方法。 方法要点：将浓度为500个细胞/ml的对数生长期细胞悬液2ml种至35ml的培养皿，并加受试样品适量，培养7d或更长时间，姬姆萨染色，解剖显微镜下计数含50细胞以上的集落。 观测指标：根据集落数计算集落形成率，对照组集落形成率不应低于40%，再计算用药组的集落形成抑制率，根据情况可进一步采用Logit法计算受试样品的IC50值。 集落形成率=集落数/细胞接种数X100% 集落形成抑制率=（1-用药组集落形成率）/对照组集落形成率X100% 体外抗肿瘤活性试验常用方法 生长曲线测定法（growth-curve determination） 试验原理：在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，此