病毒TCID50测定.docVIP

病毒TCID50测定 操作步骤(1) 准备细胞 取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。(2) 稀释待测病毒液。A法为参考书上标准的操作方法B法参照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500μl，即10-1为50μl加入450μl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100μl加入900μl孵育液中。若接种8个孔，则相应增加液体量。上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。【！此步操作注意事项：1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。2）此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。】(3) 接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100μl，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样。【切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次，计算标准差。】37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200μl继续在37℃ CO2培养箱中培养。(4) 培养将培养板放置于CO2培养箱。培养温度???? ，培养??? 天。(5) 测定结果取出培养板，显微镜下观察细胞病变。 计算方法1) Spearman-Karber 法??? LgCCID50 /0.2ml= - （X0 - d/2 + d×∑R1/N1）??? ???? X0 = 全部病变最低稀释度对数???? d = 稀释因数对数???? N1 = 每个稀释度所种的孔数???? R1 = 病变孔数?????????????????????? ∑ = 积和 LgCCID50 /ml = LgCCID50 /0.2ml +0.7 2) Reed-Muench法观察CPE, 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按计算出该病毒液的TCID50 TCID50 是指组织培养物（细胞）半数致死计量。它有几个性质我们必须明白：1）它表示的是计量，不是浓度； 2）它是一个单位；3）它的值等于1，实际上问它的值等于多少是一个没有意义的问题，就像问km的值等于多少一样，如果非要说出的的值等于多少，那我们只能说它的值在任何情况下都等于1。理解这三个性质对于理解TCID50非常重要，但是这三个性质经常被误解，所以导致对TCID50的理解出现偏差。首先我们来看一下这个表示法的意思：病毒浓度为10^8.2TCID50/ml它表示的是每ml病毒溶液里含有10^8.2个TCID50的病毒，这和氯化钠的浓度为4.5mol/L表示每L溶液中含有4.5个mol的氯化钠是一样的道理。经常可以听到人说我的病毒的TCID50是10^xx。这个说法是不科学的，应该说我这个溶液里含有多少个TCID50的病毒或者说我这个溶液的病毒溶度是xxTCID50/ml.理解了TCID50的概念之后，我们再来看看TCID50是如何计算的？请看例子： 每个所加液体的体积是0.08ml。图中给出的计算方法是有问题的，请先忽略不看。从图中我们可以知道半数致死的稀释度肯定是介于10^-6到10^－7之间，肯定可以表示成10^-6.xx。那么这个.xx到到底是多少呢？这实际上是一个线性插值的问题。求解见下图： PD/[log(dilution above 50%)-log(dilution below 50%)]=[(%next above 50%)-50%]/[(%next above 50