转基因检测国家局培训教材(基因成分检测)2011-11-24.ppt

主要内容 食品中转基因成分检测 食品中过敏原及其成分检测 食品真伪鉴别（动物源性成分检测） 第一部分 食品中转基因成分检测 一、全球转基因作物种植情况和有关法规介绍 转基因产品标识制度 2001年5月23日，国务院发布了第304号令《农业转基因生物安全管理条例》 第一批标识管理的转基因生物（5大类17种） 转基因检测国家标准 二、以核酸为基础的检测方法介绍 主要内容 1.核酸提取纯化方法 2.定性检测方法 3.定量检测方法 4.可能产生误差的原因及消除 5.案例分析 1.核酸提取纯化方法 使用标准方法 GB/T 19495.3-2004 转基因产品检测??核酸提取纯化方法 核酸提取纯化方法 A 酚-氯仿法提取DNA B PVP法提取DNA （Polyvinylpyrrolidone,聚乙烯吡咯烷酮） C CTAB法提取DNA （Cetyltrimethyle Ammonium Bromide,十六烷基三乙基溴化铵） D 硅土法提取DNA E 胍-氯仿法提取DNA 建议使用商业试剂盒 核酸提取纯化方法 酚-氯仿法提取DNA、胍-氯仿法提取DNA 利用酚和胍使蛋白质变性，释放出核酸,同时抑制了DNase的降解作用，保护核酸。 利用氯仿加速有机相与液相分层。 PVP法提取DNA、 CTAB法提取DNA 利用高浓度去垢剂在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉 淀，得到水相中的核酸。 硅土法提取DNA 利用硅土对核酸的吸附作用，分离核酸。 使用标准方法 GB/T 19495.4-2004 转基因产品检测 核酸定性PCR检测方法 主要内容 本标准方法规定了转基因产品检测的核酸定性PCR方法，适用于种子、饲料、食品和环境样品中转基因成分的定性检测。从以下五个方面进行介绍： A.方法简介 B.检测目标物 C.检测体系 D.结果判定 E.结果表述 A.方法简介 普通PCR+电泳方法 原理 聚合酶链式反应（PCR）在反应缓冲液中，脱氧核糖核酸、寡核苷酸引物在DNA聚合酶的作用下经循环反应对目标序列进行复制。 PCR产物可用琼脂糖凝胶电泳方法依据DNA分子长度的不同加以分离。 A.方法简介 缺点： 1. 普通PCR灵敏度可达到0.1％，而实时荧光PCR检测下限可达到0.01％。 2. 电泳存在EB等致癌物质，需要特殊处理。 3. 检测时间长。 B.检测目标物 1　物种特异性检测方法 大豆、番茄、玉米、油菜、马铃薯、棉属作物、真核生物18SrRNA、叶绿体多拷贝DNA序列检测方法。 2　筛选检测方法： CaMV35S启动子、 NOS终止子、 NPTII基因、FMV 35S启动子筛选检测方法。 3　结构基因特异性检测方法 抗草甘膦大豆、转基因番茄Zeneca?、转基因玉米Bt11、Bt176、T25、转基因马铃薯New Leaf? Plus、New Leaf? Y结构基因特异性检测方法。 4　品系特异性检测方法 转基因玉米MON810、抗草甘膦油菜RT73品系特异性检测方法、棉花MON531、华番一号。 C.检测体系 D.结果判定 PCR 检测时应做平行对照，两份平行样品结果应保持一致。如果一个样品结果为阳性而另一个为阴性时，应重新进行检测。可以通过增加PCR反应中DNA的模板量使两份平行样结果一致。 所检测目标片段出现扩增，且PCR产物经过确认，所有对照结果正常，结果判定为阳性，所检测目标片段未出现扩增; 所有对照结果正常，结果判定为阴性。 E.结果表述 一般要求 实验结果不能用“+/－”来表述。 阴性结果不能用“不含GMO”（“GMO not present”）来表述。 阴性结果的表述 测试报告应该包括下列内容： “对于X物种，未检测出转基因成分。 根据xxx（即标准参照物质），该方法的检测下限为X %。” 英文表述为： “For species X, GMO derived material was not detected. The LOD of the method is X % determined with xxx (identify the reference material