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T-RFLP技术 桂林医学院生物技术学院 ——程骏 T-RFLP简介 T-RFLP中文全称是末端限制性片段长度多态性（Terminal restriction fragment length polymorphism ）,又可以称为16sRNA基因的末端限制性片段分析技术。它是将目标DNA片段的一个末端(通常是5′端)用荧光标记，这样在酶切后，分析的目标只限于有荧光标记的末端限制性片段上。酶切后产生长度不等的末端限制性长度片段经过毛细管电泳分离，并经ABI自动测序仪上检测和计算后，输出末端限制性片段长度的大小和荧光强度图。测序仪上输出的图谱含有的不同波峰越多，则表明微生物种类越丰富。通过比较不同样品图谱间波峰的异同，就可以得到不同样品中菌群的差异。 T-RFLP原理 T-RFLP的技术原理是根据的保守区设计通用引物，其中一个引物的5‘末端用荧光物质标记，常用荧光物质有HEX,TET,6-FAM等。提取待分析样中的DNA，以它为模板进行PCR扩增，所得到的PCR产物的一段就带有这种荧光标记，然后PCR产物用合适的限制性内切酶进行消化，一般选用酶切位点为4bp的限制性内切酶。由于在不同细菌的扩增片段内存在核苷酸序列的差异，酶切位点就会存在差异，酶切后就会产生很多不同长度的限制性片段。消化产物用自动测序仪进行测定，只有末端带有荧光性标记的片段能被检测到。因为不同长度的末端限制性片段必然代表不同的细菌，通过检测这些末端标记的片段就可以反应微生物群落的组成情况。 这种方法还可以进行定量分析，在基因扫描图谱上，每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，即末端限制性片段的数量越大其所对应的面积越大 。 T-RFLP流程 简单的流程图： 3.1把样本的基因组提取出来 3.2以提取出来的基因组DNA为模板进行PCR反应，引物的5′端带有荧光标记物 3.3将纯化过的PCR产物用限制性酶进行酶切 3.4将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳得到大概的电泳条带图，以方便检测酶切是否完全 3.5酶切产物在DNA测序仪(ABI 3730，美国)中进行毛细管电泳检测，所得电泳图谱用片段分析软件Genescan(ABI，美国)进行分析 3.6图谱分析及数据分析 PCR（纯化） 我的实验目的和实验方法 最初是要研究IL-10这个基因对于人体有什么作用，因此用了两种小鼠来做研究，一组是正常小鼠，一组是IL-10基因敲除的小鼠，通过T-RFLP这个技术来研究两组小鼠在肠道菌群上的差异，从而了解IL-10基因对于动物肠道菌群的影响，得到这一方面的研究成果。 具体的实验步骤 一、提取样本的基因组 我提取的是小鼠粪便的基因组，用自己实验室配制的粪便基因组提取试剂盒来抽提，基因组提取的结果良好。 二、PCR PCR条件： 95℃，5 min 变性95℃，30 S 退火55℃，30 S 37个循环 延伸72℃，2min 72℃，10 min，4℃保存。 然后用DNA凝胶回收试剂盒（上海中亚）对PCR产物做一个回收，以去掉PCR反应中的杂带，保证只有800bp大小的DNA片段，去掉杂带。 下面是一次实验十六个样本PCR后的电泳图，我们PCR得到的DNA片段一定要是800bp位置的，不可出现杂带，而且对于PCR的污染要求很严格，因为这个实验用的引物是通用引物，基本上所有的生物基因组都可以P出这样的条带，所以对于所用试剂、耗材、环境要求很高，否则最后结果没有说服性。 750bp 三、酶切 选用HhaⅠ作为实验的限制性内切酶，酶切位点是GCG^C酶切体系采用40 μL, PCR 产物为6 μL,在37 °C 酶切6 h, 反应完成后, HhaⅠ在65 °C 水浴中20 min失活。酶切时间一定要控制好，不能太短，酶切没有结束就停止，因此要酶切一段时间进行一次电泳，看条带结果，决定是否停止酶切，一般都需要4~8小时。 下面是一张酶切不完全的电泳图 四、送去做T-RFLP的测序 这个实验测序是送去生工做的测序，用的是DNA测序仪ABI3730，大约3~4天能拿到，因此我的实验部分大约两周能做一次。 五、图谱分析和数据分析 这是两个同组样本的图谱，波峰大致上是相同的，这样表明这两个样本数据是比较可靠的。 T-RFLP统计学分析 对于每个图谱数据的预处理，去除荧光强度小于100和片段大小≦35或者≥500的片段数据，将剩下片段的峰面积进行标准化处理，并去除相对丰度小于1％的片段[7][8]。这批样本一共十六个，分为对照组和干预组，通过统计学分析得到右边的数据，和图谱吻合。 此外还作了聚类分析，就是将T