第五章+凝胶过滤课件.pptVIP

一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝胶形式出售，使用前必须溶胀。 特点： 不溶于水和普通有机溶剂； 能在浓盐、尿素和胍盐等溶液中浸泡； 在pH l-10或短时间超过此pH值的溶液中较稳定； 要避免长期与强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅速发生分解（高温条件）。 缺点： 对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸附现象，使用离子强度略高的洗脱液操作可以克服。 四、 Sephacryl Sephacryl 由烷基葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺共价交联制成的。属硬性凝胶，具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团。 Sephacryl 吸水时，其珠状颗粒直径平均值为70 um。通常是用于水相系统中。若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化。 特点： a. 在所有的溶剂中不溶解，化学降解很少； b. 可在pH 2-11范围内使用，当pH低时，葡聚糖链将发生少许水解作用；在0.2mol/L NaOH 溶液中（室温下）处理100小时，对其低流速和多孔性没有明显影响； c. 清洁剂（如SDS）、6mol/L盐酸胍和8 mol/L尿素溶液可作洗脱剂，高温（120℃）消毒（pH= 7时）处理后，层析性质没明显变化。 Sephacryl 能用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖（Proteoglycans）。也可用于大的病毒颗粒（直径 300-400 nm）的分离。层析时，用细颗粒凝胶分辨率高。  第二节 基本原理 凝胶过滤层析的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。 它可以完全或部分排阻大分子化合物；而不能排阻小分子化合物，让其在筛孔中自由地扩散、渗透。 凝胶层析柱排阻的化合物范围在0-100％之间。 洗脱体积（Ve）包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。?Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。 对于完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内， 故其洗脱体积 Ve ＝ Vo 对于完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，故其洗脱体积 Ve ＝ Vt 分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。 凝胶过滤的原理 凝胶层析柱洗脱曲线示意图 Ⅰ 完全排阻的大分子 Ⅱ 中等分子 Ⅲ完全渗透的小分子 分配系数：表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。 Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关。 Vo和Vt可以通过测定得到，测定了某个组分的Ve就可以得到这个组分的分配系数。在一定的条件下， Vt和Vo都是恒定值。 大分子先从柱中流出→Ve值小→Kav值小 小分子后从柱中流出→Ve值大→Kav值大 Kav ＝ Ve － Vo Vt －Vo 对于完全排阻的大分子 Ve ＝ Vo 故 Kav ＝ 0 对于完全渗透的小分子 Ve ＝ Vt 故 Kav ＝ 1 Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。 对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个组分的Kav与其分子质量的对数成线性关系： Kav ＝ －b lgMr+c 由于Ve 和Kav也成线性关系所以同样有： Ve ＝ －b lgMr+c 通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定Ve 或Kav，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后在相同条件下测定未知样品的Ve 或Kav，通过标准曲线即可求出其分子质量。 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关， LogM A B C LogM测 V测 先测得几种标准蛋白质的 Ve，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出 待测样品的Ve，查标准曲 线即可确定分子量。 LogM=k1-k2Ve （Ve为洗脱体积） 影响筛分效果的因素： 1）操作条件：如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等；2）Kav值的差异性。Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小，等于1或等于零（即使样品个各组分的分子量相差很大），则分离效果差，或根本不能分开。 第三节 操 作 一、凝胶的选择和处理 1．凝胶的选样 （1）型号凝胶型号很多。型号不同，筛分范围也不同。市售的Sephadex的分离范围，常用高聚糖或球蛋白测定。Sephadex G型适宜于分离蛋白质。若用于分离核酸，则受其空间结构和所带基团的影响，选用高于它们分子量范围的型号，或者选用适当型号的生物胶和Sephacryl。  在去除蛋白质溶液中的盐类时，可选用凝胶Sephadex G-25。当溶液