第八章 目的基因的表达课件.ppt

由于酿酒酵母不能识别和处理高等真核内含子，因而须使用cDNA。 酵母生产外源蛋白的最佳表达盒包括有效的启动子序列（可为诱导性或组成性），目的蛋白cDNA和转录终止序列。 使用酿酒酵母表达系统需考虑问题： ①启动子和终止子的选择； ②表达盒的稳定性； ③外源蛋白的累积部位； ④产量的提高。 二．甲醇酵母中外源基因的表达 甲醇酵母，如Pichia pastoris和Hansenula polymopha，既保持了酿酒酵母的优点，还能大幅度提高产量，部分解决了糖基化问题，能在简单的培养基上利用甲醇为惟一碳源。 在利用甲醇路径中，第一个用在P. pastoris中的酶为乙醇氧化酶(AOX)，在H. ploymorpha中为甲醇氧化酶(MOX)，而且AOX/MOX表达为高度调控的，完全诱导都需要甲醇的存在。 在甲醇中生长时，这些酶约占细胞蛋白总量的30％。表达AOX/MOX的强大可调控启动子已用于生产重组蛋白。其表达框能够与宿主整合，并在非选择生长时保持稳定。 P. pastoris 表达载体包括AOX启动子、 AOX序列、 AOX终止序列，其中的多个克隆位点供外源基因插入，以组氨酸脱氢酶基因(HIS4)为互补性筛选标志，还包括部分pBR322质粒序列，使之成为在大肠杆菌中繁殖的穿梭质粒。 将表达载体酶切后线性化，整合于酵母基因组AOX或HIS4基因位置，可随酵母生长稳定地存在。甲醇酵母能大量分泌异源蛋白，对质粒也能发生高频整合，用一系列方法可增加拷贝数，提高产量。 三．酵母表达外源基因的缺陷和解决方法 1）在转译异源蛋白时，遗传和转译的稳定性常受影响，如点突变等。 点突变可通过大量的基因拷贝数解决，原因是突变会被大量的正常基因覆盖掉。 2）转译产物不稳定，可利用蛋白酶缺陷型菌株来解决，防止产物降解。 3）转译错误可通过对DNA修改来防止，如选用酵母合适的密码子以避免错误地插入tRNA和由于使用酵母中稀有密码子而引起的转译中断和移位，以提高正确的产物产量。 4）要得到有活性的成熟产物，选择转译后具修饰能力的酵母及合适的载体。 5）生产分泌蛋白时，能够糖基化和形成二硫键，而且能在信号肽的引导下进行分泌，但用KEX2蛋白酶除去α-因子的前导肽序列常不够完全，导致分泌蛋白有一个过长的氨基酸末端。 可采用氨基末端间隔序列解决，在α-因子的前导肽序列和产物之间加1个间隔序列，这个间隔序列肽可在体外或体内用特异蛋白酶或酵母天冬氨酰蛋白酶切除。 2）外源基因的表达产物常常会被宿主细胞的蛋白酶所降解，当外源基因与宿主本身的某种蛋白(如β-半乳糖苷酶)的部分编码序列构成融合基因，以融合蛋白的形式表达时，往往会减低宿主细胞对产物的降解。 3) 通过融合表达为蛋白纯化提供便利： 将外源目的基因与一段“亲和手柄”的编码序列相连接，这段“亲和手柄”可以与亲和层析柱上的配基特异性地结合，这样所表达的融合蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来。 所得到的融合蛋白经化学方法或酶法切割开来之后，混合产物再上同一亲和柱，充作“亲和手柄”的一段多肽或蛋白以及尚未被切开的融合蛋白被吸附于柱上，而重组目的产物则处于流动相中。这样，经过比较简单的几步即得到较高纯度的重组目的蛋白。 4) 通过融合表达的方式促使产物以包含体的形式表达，产物表达量往往比较高。 5) 通过融合表达使产物以可溶性的方式表达。 6) 融合蛋白是避免细菌蛋白酶破坏的最好措施。 一、大肠杆菌表达系统的特点 二、大肠杆菌表达融合蛋白 三、大肠杆菌细胞包含体 四、提高克隆基因在大肠杆菌表达效率的途径 某些目的蛋白在大肠杆菌的表达形式是细胞内的包含体。 外源目的基因产物在大肠杆菌宿主中有可溶性表达与包含体表达两种形式。 可以避免宿主的降解。 当以包含体表达时，目的基因产物的表达量也往往比较高， 包含体容易纯化，往往仅通过简单的差速离心及洗涤等几步即可得到较高纯度的目的蛋白。 当所表达的重组蛋白产物对宿主细胞具有毒性时，使重组目的产物以无活性的包含体形式表达可能是蛋白表达的最佳方式。 包含体表达的优点 当以包含体形式表达时，外源目的蛋白表达产物需经过变性、复性等手段才能得到有生物活性的蛋白。而提取的手段复杂，并且回收率较低。 未形成包含体的水溶性活性物质在提取过程中容易损失。 包含体表达的缺点 虽然目的基因产物以包含体形式表达有不少优点，而且近年来随着蛋白复性技术研究的发展，许多目的基因产物得以通过包含体变性、复性的方法以一定的收率得到最终的产品。 然而迄今对于包含体的复性尚未有一个普遍适用的有效方法。适宜的复性条件一般都是经过实验摸索而得出，并且这些条件往往随目的蛋白的不同而不同。 另外，生产规模的包含体变性复性的产物纯化过程，其费用亦相对较高。 如何能在大肠杆菌中直接表达出已正确