5目的基因的获取分析.ppt

反转录酶 （3）cDNA的合成 ① cDNA第一链合成 逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。 mRNA cDNA 3’ 5’ 5’ AAAAAAA TTTTTTT Oligo dT引物 用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。 mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反转录酶 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 3’ 5’ 5’ 引物 cDNA第一链 3’ 5’ 引物 ② 降解mRNA模板 或RNaseH 碱 剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。 cDNA第一链 5’ cDNA第二链合成 DNA聚合酶 cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ ③ cDNA第二链合成 ④去掉发卡结构 核酸酶S1 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。 cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ 5’ 3’ 这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。 妙用RNaseH 小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。 DNA Po