生物芯片的制作.pptxVIP

生物芯片的制作409本节要点生物芯片制作方法生物芯片制作的主要步骤芯片片基的制作点样样品芯片杂交生物芯片的制作方法一般有三种方法1.原位合成法：指根据预先设计的点阵序列在每个位点通过有机合成的方式直接聚合得到所要求的探针分子。聚合之后芯片片基的制作即告结束。该方法有两类：原位光刻合成与压电打印法。2.点样法：直接将核酸片段“点”至被包被过的芯片表面做靶片段。3.分子印章原位合成法：该方法根据阵列合成的要求设计并制作表面凹凸不平的分子印章，再按照合成的顺序，将寡核苷酸合成试剂涂布在不同的印章上，逐个依次压印到芯片特定位点进行合成反应。原位光刻合成原位光刻合成的简要过程：首先使支持物羟基化，并用光敏保护基将其保护起来。每次选择适当的蔽光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基脱保护而活化。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位在反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序，就可以实现与待定定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。优点：合成效率高，点阵密度高缺点：设备昂贵，技术复杂，反应产率低。原位光刻合成原位光刻合成基本原理图压电打印法压电打印法的简要过程：其装置与普通的的彩色喷墨打印机相似，所以技术也是常规的固相合成方法。即，将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂替代，支持物经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试剂喷洒到特定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相合成技术。可以合成长度为40-50个碱基的探针。优点：设备廉价，技术相对简单，反应产率高缺点：点阵密度低，易产生交叉污染。压电打印法点样法点样法的简要过程：是将预先通过液相化学合成好的探针、PCR扩增技术cDNA或基因组DNA经纯化、定量分析后，通过由阵列复制器或阵列点样机及电脑控制的机器人准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片相应的位置上，再由紫外线交联固定后即得到芯片。优点：设备廉价、技术简便、研制周期短、灵活性高缺点：点阵密度低点样法点样法的方式1.接触式点样点样针直接与固定支持物表面接触，将DNA样品留在固定支持物。2.非接触式点样（喷点）它是以压电原理将DNA样品通过毛细血管直接喷至固相支持物表面点样法主要步骤1.芯片制备目前制备芯片主要是以玻片或硅片为载体，采用原位合成和点样的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序加载到载体上。制备材料：准备固定在芯片的生物分子样品、芯片片基、制作新片的仪器2.样品制备将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用的安全性。3.杂交反应4.信号检测和结果分析芯片片基的制作芯片片基即载体材料目前常用的芯片片基都选择经过相应处理的硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等作为支持物。做原位合成的支持物在聚合物发应前要先使其表面衍生出羟基或氨基（视所要固定的分子为核酸或寡肽而定），并与保护基建立共价连接；作点样用的支持物，为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸 芯片片基的制作 两种常见的载体1.膜优点：与核酸亲和力强，杂交技术成熟，通常无需被宝贝2.玻片优点DNA样品以共价键的形式结合在处理过的玻片上；玻璃是种耐用的材料；能提高探针与目的分子的退火效率不会有背景影响。由玻片为载体的芯片更具有的发展和应用的前景点样样品点样样品点样样品的制备是非常关键的一步。样品的纯度、杂交特异性直接决定自制芯片的质量和可信度对于大规模制作芯片的用户，由于点样样品数目太多，即采用高通量试剂盒还是不够方便，可以采用全自动核酸和蛋白质纯化工作站。芯片杂交DNA杂交：当两个来源不同的单链DNA分子（DNA片段）核苷酸序列互补时，在复性条件下，可以通过碱基互补配对成为双链“杂种”DNA分子（DNA片段）的过程。DNA杂交探针：指带有某种标记物的特异性核苷酸序列，能与该核苷酸序列互补的DNA进行退火杂交，并可以根据标记物的性质进行有效的检测。（早期用的是32p）杂交的方法有southern印迹杂交、斑点印迹杂交和菌落(或噬菌斑)原位杂交等。芯片杂交方法southern印迹杂交：先从转化子中提取总DNA，经限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分带，转移到用于杂交的膜上，变性处理在用DNA探针与其杂交。斑点印迹杂交：把提取的转化子总DNA直接点样到用于杂交的膜上，变性处理后再用DNA探针与其杂交。菌落原位杂交：直接把菌落或噬菌斑印迹转移至用于杂交的膜上，经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，在用DNA探针与其杂交芯片杂交方法s