浙江大学生物化学实验甲 2011-蔗糖酶蛋白质浓度和酶活性测定的原理课件.pptVIP

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2016-12-21 发布于浙江
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浙江大学生物化学实验甲 2011-蔗糖酶蛋白质浓度和酶活性测定的原理课件.ppt

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蔗糖酶蛋白质含量和酶活力的测定原理一、蔗糖酶蛋白质含量的测定—— 福林-酚法（Lowry法） ????? 1.1、Lowry法的原理 Lowry法是由两组试剂作用于蛋白质产生有色物质，通过比色测知其蛋白质含量的方法。这两组试剂包括磷钼酸及磷钨酸的混合试剂（福林-酚试剂）和碱性铜试剂。其测定蛋白质含量的原理如下：一、蔗糖酶蛋白质含量的测定一、蔗糖酶蛋白质含量的测定 1.2、比色法的测定原理磷钼蓝和磷钨蓝的OD640 值与溶液中的蛋白含量成正比，如以蛋白含量为横坐标， OD640值为纵坐标，二者之间的关系应为直线。由未知样品的OD640值，通过标准曲线，用作图法即可知道未知样品的蛋白含量。如右图：一、蔗糖酶蛋白质含量的测定 1.3、Lowry法的特点 Lowry法测得的含量为蛋白质的相对含量，样品浓度需按标准曲线进行校正。可测范围：2-100微克。操作比较简单，重复性较好，是至今生物化学研究中应用最多的方法。缺点：酚类和其它具有还原性的物质对显色反应有干扰，另外，该法标准曲线线性不是很好，因此每次测定均需制作标准曲线。一、蔗糖酶蛋白质含量的测定 1.4、材料及试剂 1、实验材料未知蛋白样品 2、实验试剂标准蛋白质溶液配制见P89。福林-酚试剂的配制及注意事项解说见P89。 1.5、实验步骤实验中的注意事项及解说详见实验讲义P-89。一、蔗糖酶蛋白质含量的测定 1.6、试验结果及处理 1、标准曲线的制作。将所得的试验数据以蛋白含量为横坐标， OD640值为纵坐标，绘制标准曲线。 2、未知样品蛋白含量的确定。根据未知样品的OD640值，通过标准曲线求出未知样品的蛋白含量。二、蔗糖酶活力的测定原理蔗糖酶活力单位（units）：在50℃，pH4.6条件下，每分钟能产生1mg还原糖的酶量。 * * 碱性铜试剂铜-蛋白质络合物（双缩脲反应）试剂甲紫红色蛋白质磷钼酸-磷钨酸磷钼蓝 + 磷钨蓝蓝色，640nm处有特征光吸收，OD640 值与溶液中的蛋白含量成正比, 可据此通过比法色测定蛋白质的含量。 (福林-酚试剂) 试剂乙铜-蛋白质络合物蛋白含量 (ug) OD640 未知蛋白含量 (ug) OD640 未知还原糖 + 3，5-二硝基水杨酸糖酸 + 氨基化合物 OH- △ 红棕色，540nm处具特征光吸收，OD540值与还原糖含量成正比，可据此进行比色测定。（DNS试剂）蔗糖葡萄糖 + 果糖蔗糖酶 H2O CH2OH OH O OH OH HO CH2OH O HO OH HO CH2OH + *