8哺乳动物表达系统课件.ppt

哺乳动物基因工程 基因工程的基本概念 D 高等哺乳动物的基因转移 A 高等哺乳动物基因工程的基本概念 B 高等哺乳动物的受体系统 C 高等哺乳动物的载体系统 D 高等哺乳动物的基因转移 E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白 哺乳动物细胞的物理转化法 通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌鼠，从其输卵管内取出受精卵； 借助于显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄性原核内。 上述程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞逐一操作，所以不太适用于基因的克隆和表达。 显微注射法 哺乳动物细胞的物理转化法 血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被细胞膜包裹的细胞核结构。在溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的同时，外源DNA也容易进入。当上述外界条件消失后，红细胞膜又可恢复原来的通透性。因此，可先将外源DNA转入血影细胞，然后再将血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源DNA转入受体细胞。 血影细胞介导法 哺乳动物细胞的病毒转染法 以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。 8 哺乳动物基因工程 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体 利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂 利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊 方式。氨甲喋呤（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶 数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩 增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶 通过强化基因扩增高效表达外源基因 （DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多 的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区 哺乳动物细胞内的基因扩增现象 域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增。 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 通过强化基因扩增高效表达外源基因 DHFR-MTX高效表达系统 外源基因 dhfr 转染dhfr -细胞系 单克隆 培养 转移 0.05 mM MTX 培养 单克隆 转移 培养 单克隆 转移 5 mM MTX 0.25 mM MTX 培养 单克隆 外源基因扩增至100拷贝 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 通过强化基因扩增高效表达外源基因 GS-MSX高效表达系统 谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亚砜（MSX）对动物细 胞的毒害作用。先将带有GS编码基因的载体转入培养的哺乳动物细 中不必使用GS缺陷型的受体细胞，而且在正常的MSX浓度下就能筛 选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR- 胞中，由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX，所以在转染过程 MTX系统优越之处。 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 通过强化基因转录高效表达外源基因 在载体上安装病毒或细胞来源的强启 Ap r M13 ori ColE1 ori CMVP Polylinker Gene Intron SV40 T PolyA signal 高效表达载体 mRNA前体 AAAAAAAAA mRNA 动子以及有效的翻译元件，也是使外源基 因高效表达的一种手段，如： 细胞巨化病毒CMV的启动子 动物珠蛋白基因的内含子 SV40的终止子和polyA化信号序列 绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体 上携带内含子结构，因为mRNA前体的剪 切能促进成熟mRNA向胞质的运输，有利 于翻译。有的还含有各种信号肽序列。 基因工程 5 2 3 4 1 6 7 8 9 基因工程的基本原理 基因工程所需的基本条件 基因工程的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建 大肠杆菌基因工程 酵母基因工程 哺乳动物基因工程 高等植物基因工程 8 哺乳动物基因工程 C 高等哺乳动物的载体系统 B 高等哺乳动物的受体系统 A 高等哺乳动物基因工程的基本概念 E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白 8 哺乳动物基因工程 高等哺乳动物基因工程 高等哺乳动物细胞基因表达技术 高等哺乳动物转基因技术 转基因动