DNA重组和基因转移课件.ppt

第七章 DNA重组和基因转移 第一节 目的基因与载体的连接 一、粘末端DNA片段的连接 二、平末端DNA片段的连接 1、直接用T4连接酶连接 2、同聚物加尾法 3、衔接物连接法 三、载体与DNA片段酶切位点不匹配的连接  四、cDNA与载体的连接 第二节 重组DNA分子的筛选与鉴定 外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的三种情况： 一、遗传检测法 （一）根据载体表型特征选择重组体分子 2、α—互补 例；pUC质粒 二、物理检测法 1、凝胶电泳检测法 2、R-环法 三、核酸杂交检测法 例：原位杂交筛选重组体菌落(或噬菌斑) 四、免疫化学检测法 五、DNA-蛋白质筛选法 六、转译筛选法 1．杂交抑制转译 2、杂交选择转译 第三节 基因转移方法 一、重组DNA导入大肠杆菌 （二）转染 （2）λ噬菌体的体外包装 λ噬菌体的体外包装的原理： 二、重组DNA导入植物细胞的方法 （一）载体介导的转化方法 （2）叶盘共培养法 图 （3）悬浮细胞或愈伤组织共培养 （4）活体接种(inoculation in vivo) 2、病毒介导的基因转移 （1）双链DNA病毒转化载体 （二）DNA直接导入法 1、物理方法 基因枪示意图 （2）电激法(electroperation) （3）微注射法（micro-injection） （4）激光微束法(laser microbeam) （5）超声波法 2．化学方法 （1）PEG法 3、种质系统法(germ line transformation system) （1）花粉管通道法（pollen-tube pathway） （2）浸渍法 （3）胚囊和子房注射法 三、重组DNA导入动物细胞的方法 2、DEAE-葡萄糖转染技术 3、电穿孔转染技术 这类病毒是以双链DNA作为遗传物质，在这类病毒中，目前研究的最多的是花椰菜花叶病毒（简称CaMV, Caullinus Mozic Virus）。 （2）单链DNA病毒转化载体 GeNV顾名思义，可翻译成“双联体病毒”或“孪生病毒”。GeNV的感染范围较广，包括单子叶和双子叶植物，它们的传播媒介是昆虫。 （3）单链RNA病毒转化载体 迄今为止，还没有建立起一个完善的以植物RNA病毒为基因载体的基因转化体系，但是RNA病毒仍是一个很有希望作为基因工程载体的植物病毒。 （1）基因枪法 80年代末期，由康奈尔大学的Sanford最先提出，主要是为了克服以往各种基因转化技术的局限。 该方法是利用一种物理仪器装置，将钨、金等金属微粒加速冲击细胞，把细胞击孔，使目的基因进入受体。 首先将钨、金微粒(直径约0.4μm，重量约0.05mg)与供体DNA溶液(1～2μl)混合并保温，使DNA吸附在金属微粒的表面，然后将该溶液置于所谓的“基因枪”仪器中，仪器高压放电将金属微粒加速，直接喷射受体原生质或细胞，细胞击穿成孔后，在钨粒上的DNA以及溶液中的DNA都可以进入受体细胞。 操作技术程序为： 基因枪所用材料： （1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。 （2）将DNA包被到微载体上所用的试剂有亚精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等，但多用前两种。 （3）所用动力系统：一类以火药爆炸力作为动力加速微弹；另一类以电弧放电蒸发液滴作为动力；第三类以高压蒸汽作为动力。 基因枪法的特点：（1）转化效率高。 （2）受体广泛。 （3）操作简单。 电激法是利用高压电脉冲的作用对原生质体或细胞击出微孔而使基因转移的一种新方法。 原理：细胞生物学研究证明，细胞膜的磷脂双分子层可视为一种电容，其静膜电位（Vm）约为l00mV，导电性很差。当把细胞置于外加电场中时，会使膜电位升高，双分子层两端电压形成差势，随着外加电场电压升高，细胞膜被压缩变薄，当膜电压升到一定数值时，膜被击穿。 可逆击穿：击穿小孔可在一定时间内复原。 不可逆击穿：击穿小孔不可修复，处理细胞成活率低。 操作程序： 将盛有细胞和DNA混合物的特制小容器置于电脉冲仪的正负极之间，在0度下加高压（2～ 4KV），电脉冲10分钟后，将待处理的细胞转移到新鲜培养基中生长2天，再进行筛选。存活细胞的回收率约为60%～ 80%。 微量注射：用注射针或微针在受体细胞或组织穿刺成孔，DNA随穿刺孔进入细胞或随穿刺针头—道进入。 真正的显微注射：利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化方法。 显微注射技术的关键是原生质体或具壁细胞或细胞团的固定。对于植物细胞而言，首先必须建立固定细胞技术，然后才能进行定位显微注射操作。常用的细胞固定方法有3种： 一、琼脂糖