叶绿素含量的测定课件.pptVIP

实验二. 叶绿素含量的测定 高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。 在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。 一.实验原理 叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。 叶绿素a、b在长波的最大吸收峰分别在663nm、645nm，据Lamber-Beer 定律，可得浓度C与光密度D间的关系式： D663=82.04Ca +9.27Cb D645=16.75Ca +45.6Cb (浓度单位：g/mL） CA= 12.72D663 – 2.59D645 CB= 22.88D645 – 4.68 D663 CT = 20.29D645 +8.02D663 (浓度单位：mg/L） 二. 试剂与材料 2.1 试剂： 丙酮、石英砂、碳酸钙 2.2材料： 水稻、玉米、花生、桑树等植物的新鲜叶片。 2.3 仪器与器皿： 分光光度计、台秤、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管 三. 实验步骤 1．取样：清洗叶片并擦干,称取0.5g叶片，剪碎后放入研钵中。（在正规实验中应各重复3次，本实验为减少乙醇或丙酮向环境中的排放，故不设重复）。注意取样时要避开大的叶脉。 2．研磨提取：向研钵中加入96%乙醇或80%丙酮2ml，以及少许CaCO3 (中和酸性，防止叶绿素酯酶分解叶绿素) 和石英砂，研磨成匀浆，至组织变白，在暗处静止3-5min后，用滤纸过滤到25ml容量瓶中。 注意：用滴管吸取96%乙醇或80%丙酮将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用96%乙醇或80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用96%乙醇或80%丙酮定容至刻度。 3．读取吸光度：取厚度为lcm的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗2~3次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（注意不能擦），再用擦镜纸擦干擦净。 4．结果计算：将645、663、652nm处测得的吸光度代入公式（3）、（4）、（5）、（6）中计算叶绿素a、b浓度和总浓度。再将叶绿素a、b浓度和总浓度代入公式（7）中求出所测材料单位重量或单位面积的叶绿素a、b含量和总含量。 叶片洗净、吸干、去大叶脉 ↓ 称0.5g叶用乙醇或丙酮研磨 ↓ 匀浆过滤（用乙醇或丙酮洗研钵及残渣，合并滤液） ↓ 滤液用乙醇或丙酮定容至25mL ↓ 置分光光度计测定 (注意:不同提取溶剂波长不同) 四. 结果计算 4.1 结果计算 C(mg/L)×提取液总量（L）×稀释倍数 Chl = (mg/g叶) 材料鲜重（g） 4.2 比较分析不同植物的叶绿素含量差异及同种植物在不同生长环境下Chla/Chlb差异。 五. 注意事项 注意叶绿素一定要提干净，避免造成测定误差 叶绿素初提液体积不要太多，以免浪费试剂，如果浓度太高可进行适当稀释 注意分光光度计的规范使用 六. 思考题 为什么植物在不同生长环境下其 Chl含量有差异？ Chla /Chlb有何适应意义？ * * 将比色皿放入仪器的比色皿架上，注意不要将溶液撒入仪器内。第一个位置放盛有96%乙醇或80%丙酮的比色皿，做为空白对照。将仪器波长分别调至663、646、470nm处，以96%乙醇或80%丙酮做为空白对照调透光率100%，分别测定溶液在上述三个波长下的吸光度。每个样品重复测定3次。注意，每次在转换波长时，都要用80%丙酮调透光率100%。 *