高效液相色谱(HPLC)柱效测定.docVIP

实验高效液相色谱(HPLC)柱效测定. 实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 3、了解高效液相色谱法在分析中的应用。 . 实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为：　R＝ 2[t(R2)-t(R1)] W1＋W2式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的峰宽。 除另外有规定外，分离度应大于1.5。 苯二甲酸酯，又酸酯，缩写PAE被用它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。 研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用， 表1柱测试条件 出峰次序 样品组成 1 2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP) 3 邻苯二甲酸二丁酯(DBP) 如果要检测，可按表1配制几种物质的混合溶液，在同条件下进行HPLC分离检测.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用），高纯水 . 实验步骤 1、色谱条件 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8） 柱温：室温 流动相：高纯水：0％，甲醇：0％ 检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm； 进样体积：μl定量环，实际注射每次可控制在μl。 2、待测溶液的配制3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液0ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用-水（：）、-水（：0）纯作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。 .实验结果 t/min 0 2 3 7.5 甲醇比例 80% 80% 95% 80% 　R==3.48(注:此处及以下都为第一个峰和第二个峰的分离度) （2） t/min 0 2 3 7 甲醇比例 80% 82% 100% 80% R===3.77 （3） t/min 0 2.5 3.5 6 甲醇比例 80% 95% 100% 80% R===2.90 （4） t/min 0 1 2 6 甲醇比例 80% 95% 100% 80% R===2.59 (5) t/min 0 0.5 1.5 6 甲醇比例 90% 95% 100% 90% R===1.361.5,两峰没完全分离 六. 思考题 图2 缓冲液作流动相得出的色谱图 图3 乙腈-水（5：95）作流动相得出的色谱图 用缓冲溶液作流动相，可能造成色谱柱填料被化学破坏，这种对色谱柱固定相及键合相的破坏通常是不可修复的 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 总之，尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （3） 请分析实验结束后，怎样清洗柱子。分为两种情况，第一种情况为流动相用到缓冲溶液，第二种情况为流动相不用缓冲溶液？ 1）对于使用过缓冲液的柱子，必须先将体系中盐分去除干净，然后再以强溶剂清洗。通常可以同浓度但不含缓冲液成分的流动相洗20倍柱体积，亦可直接以纯水洗至柱内无盐后再改换成强溶剂洗脱。对于以20倍柱体积或更多一些的强溶剂加以清洗。例如，90%~100%的甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃等。如果效果不理想，则可换用更强的溶剂清洗，例如，将系统逐步置换至乙酸乙酯、异丙醇、氯仿、烃类（如己烷、庚烷等）。也可以在甲醇、乙腈等水溶性溶剂之后，改用50%DMSO或DMF水溶液加以清洗。清洗几十倍柱体积后，逐步置换返回原系统1.与气相色谱法比较，液相色谱法不受试样挥发度和热稳定性的限制，非常适合于分离生物大分子，离子性化合物，不稳定的天然产物以及其它各种高分子化合物等。液相色谱中的流动相不仅起到使试样沿色谱柱移动的作用，而且与固定相一样，与试样发生选择性的相互作用，这就为控制改善分离条件