3 酶的分离纯化-2课件.ppt

在浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到 满意的分离效果。因此，把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶。对于 一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试， 而后选出适宜的凝胶浓度。 用于研究大分子核酸的凝胶多为2.4%的大孔凝胶，此时凝 胶太软，不易操作，可加入0.5%琼脂糖，或在3%凝胶中加入20% 蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。 back 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 系统的不连续性表现在以下几个方面： 1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。 在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高. 8.3 8.3 8.9 6.7 凝胶层由上至下分别为：样品胶、浓缩胶、分离胶 样品胶 包含样品的大孔径凝胶 浓缩胶 用于样品浓缩成导线的大孔径凝胶，不含样品，其它与样品胶一样 分离胶 使样品中各组分电泳分离的孔径较小的凝胶 back SDS-凝胶电泳 在聚丙烯酰胺凝胶制备时，加入1~2%的SDS（十二烷基硫酸钠）而成。1967，Shapiro等发现。 前述的凝胶电泳中，迁移率主要取决于蛋白电荷及分子大小及形状； SDS-凝胶电泳中，电泳迁移率取决于蛋白分子量大小，而与其分子形状及其所带电荷无关，故该方法主要用于测定蛋白质或酶的分子量。 两种不同形式的电泳 为什么SDS-凝胶电泳会不受蛋白分子所带电荷及分子形状影响呢？ SDS阴离子带负电荷，SDS-蛋白质复合物上结合大量阴离子掩盖了蛋白质间原来的电荷差别； SDS与蛋白结合后引起蛋白质构象变化，在水溶液中变成长椭圆形，短轴均为18A，长轴与蛋白分子量成正比。 五、等电聚焦电泳IEF 在电泳系统中加入两性电解质载体（在电场中能够形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度），当不同蛋白质等进入该体系中即移动（聚焦）到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的蛋白质得以分离。 IEF原理 pH连续增高 pI点 （1）分辩率高（等电点仅差0.01~0.02pH）； （2）防止扩散； （3）不管加样部位； （4）样品稀，重现性好； （5）测定等电点准确。 等电聚焦电泳显著特点 等电聚焦电泳缺点 （1）要求无盐溶液，会产生沉淀； （2）对在等电点时溶解度低的组分不适。 附： 酶的组合分离纯化策略 Resolution（分辨率） Speed（速度） Capacity（容量） Recovery（回收率） 设计分离纯化工艺的基本要求 在实践工作中选择方法时: 首先应对被纯化的酶的理化性质(如溶解度、分子量大小、稳定性和解离时电学性质等)有—个比较全面的了解，这样，就可以知道在分离纯化时可以选用那些方法和条件，避免哪些处理，从而得到好的纯化效果; 其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以测定酶活性为标准。 一个好的方法和条件是比活力提高得多，总活力回收多，而从重复件好;在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和条件。因为这样不能使纯度进一步提高，而只能使酶的总活力下降。 再者要严格控制操作条件。随着酶的逐步纯净，杂蛋白含量亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降,酶更不稳定，因此,更要防止酶变性。 酶分离纯化过程中一些数据的处理 在酶的分离纯化过程中．每步都须做三件事：第一，测定酶活力(IU/m1)；第二，测定蛋白质含量(mg/m1)；第三，测量体积(m1)。将测得数据加以整理. 例如对番麻(Agave americana)蛋白酶的分离纯化，主要步骤为：叶片经30％乙醇水溶液压榨提取，用冷丙酮制成干粉，经Sephadex G—50柱层析和SP—Sephadex C—50纯化，获得结晶。纯化结果如表下表: 本章 目录 第六节 层析分离 是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数等）的不同，使各组分在两相中的分布程度不同而达到分离。 层析分离中一个相是固定的,称为固定相; 另一个相是流动的,称为流动相; 各组分移动速度步同,使不同组分分纯化; 层析分离设备简单,操作容易; 层析分离 层析柱 表4-5 层析分离方法 层析方法　　　　　　　　　分离依据 吸附层析　　　吸附力不同 分配层析　　　各组分在两相中分配系数不同 离子交换层析　离子交换剂上解离基团对离子亲和力不同 凝胶层析