AB串联四极杆分析步骤分析步骤-1课件.pptVIP

* LC-MS/MS样品分析一般步骤 SEP 16 2002 准备工作1.核对样品,名称,编号.2.通过询问送样人,查阅文献等,了解样品其他知识,例如熔点,沸点,溶解性等理化性质,样品来源,光谱,波谱数据等, LC条件,可能的杂质,样品含量,色谱柱类型,规格,流动相,流速等等.原来溶剂,若不合适,N2吹干,再用甲醇或乙睛定量溶解.保存状况,对温度,光敏感否, 送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求.3.浓度非常低的样品不能保存太长时间, 容器吸附、分解等原因使样品浓度降低,标准品工作液现配现做. 先定性后定量 首先,察看存在哪些离子,通过改变DP,观察离子的增减,M+1,18,23等等,初步判断分子量,再进行PRODUCT SCAN,找出碎片信息,从中选定MRM需要测定的一对或更多离子对,为最后LC-MS/MS联用做准备. 特征离子的质量色谱在复杂混合物分析及痕量分析时是 LC／MS测定中最有用的谱图，当样品浓度很低时LC的TIC上往往看不到峰,此时,根据上一步得到的分子量信息,输入M+1或M+23等数值,观察提取离子的质量色谱图,检验直接进样得到的信息是否在LC-MS上都能反映出来, 确定LC条件是否合适,然后进行MRM测定. 正离子方式常出现如下离子:-Na 22 Da. higher than M+H-K 38 Da. higher than M+H-Li 9 Da. higher than M+H-NH4 17 Da. higher than M+H-ACN 40 Da. higher than M+H2M+H,2M+Na等 负离子方式常出现如下离子:-TFA 114 Da. higher then M-H (113 and 227 background)-Acetate 60 Da. higher then M-H-Formic 46 Da. higher then M-H?-Cl 36 Da. higher than M-H 根据样品性质确定离子化方式: 高极性化合物,大分子,蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子；胺类、季铵盐等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯等,适合ESI(IS)。弱极性/中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲酸等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯、脲等，适合APCI（HN）。ESI不行的：极端非极性化合物如苯等;APCI不行的：非挥发性样品;热稳定性差的样品。碱性化合物宜用正离子方式，酸性化合物宜用负离子方式，如未知,可能正负都要做,有些化合物正负都出峰,选择灵敏度高的方式,不明确的优先用正离子方式试。 影响分子量测定的因素 1）PH的影响-正离子方式PH要低些,负离子方式PH要高些,除对离子化有影响外,还影响LC的峰形,以至定量误差。 2）气流和温度,当水含量高及流量大时要相应增加. 3）溶剂和缓冲液流量,流速适当高可以提高出峰灵敏度.  4）溶剂和缓冲液的类型, 正离子甲醇好,负离子乙腈好些,不挥发性盐的影响-大量累积使仪器灵敏度下降. 5）根据样品结构和性质,选择合适的液相色谱类型. 6）合适的电压-样品在源内分解或碎裂,温度,DP电压要适当. 7) 杂质的影响,溶剂的纯度,水-纯净水,当成分复杂，杂质太多时,竞争使被测物离子化不好,同时使LC分离不好.  8）样品浓度不够-浓缩.  样品的预处理常用方法有: ? a）超滤 ? b）溶剂萃取／去盐 ? c）固相萃取 ? d）灌注（Perfusion）净化／去盐 ? e）色谱分离 ? 反相色谱分离 ? 亲和技术分离 母离子选M+H,或M-H最好,但有时只有M+NH4,M+Na等,这样CAD能量可能需要高些,子离子当然选相对丰度高的,可以不只一个,通过优化仪器参数,使得母子离子都达到一定强度平衡,使MRM灵敏度最高. 色谱柱的选择原则:定性可长些,定量尽量短,提高效率,细径柱如2mm的,1mm的,IS可不分流,如4.6mm柱用1ml流量时灵敏度还不是最佳,不如流量低时更好. 优化仪器,先用注射泵优化COMPOUND项下面的参数,如DP,CE及CAD等,再接通LC用FIA优化其他参数及源位置,或接一个三通,样品仍由注射泵进入离子源,同时LC保持需要的流量. 内标物与被测物的化学性质有区别时,要注意干扰基质对他们的离子化影响的不同，尽量选同系物。 * * *